家蚕主要经济性状功能基因组与分子改良研究

项目名称： 家蚕主要经济性状功能基因组与分子改良研究首席科学家： 夏庆友 西南农业大学起止年限： 2005.12至 2010.11依托部门： 教育部 重庆市科委2一、研究内容1 拟解决的关键科学问题 针对丝绸产业质量低、效益差、结构矛盾突出等关键问题， 拟在家蚕基因组信息的基础上，以家蚕重要功能基因的克隆为出发点，在科学上重点揭示丝蛋白合成、性别决定、免疫和发育的遗传机制，探 讨家蚕 产量、质量和抗病性等重要经济性状形成的分子机理；在技术上解决如何利用基因工程改良家蚕品质，通过遗传调节提高家蚕生产性能问题。拟解决的科学问题的具体内涵是：11 家蚕品质改良的理论基础 丝蛋白合成和抗性是两个家蚕主要的生产性状，其改良的理论基础是遗传机制。其中，茧丝 是丝绸产业的原料，是行 业产量和 质量效益的主要决定因素。虽然蚕茧品质和产量性状主要由多基因支配，但其分子基础是丝蛋白的合成。因此，有哪些基因参与了丝 蛋白的合成？它们形成了什么样的生化途径？是两个首要解决的问题。其次，要回答主要结构基因（丝 素、 丝胶和 p25 基因）的调控领域结构，相关的调控因子是什么？主要结构基因全序列在不同遗传材料中的多态性是什么？以及主要基因的蛋白质产物特征是什么等问题，这是探讨茧丝质量和产量形成遗传基础的关键。而抗病性是家蚕另一个主要经济性状，如何提高家蚕的抗性？其关键在于了解家蚕对病毒、细菌和真菌等主要病原微生物的免疫机制。由于家蚕抗微生物肽是其主要的抗菌分子，因此，在已 经获得了家蚕主要抗菌肽基因的基础上，重点要回答这些基因的具体抗菌功能是什么，通过对不同抗性材料的研究，回答主要免疫基因与抗性形成的关系是什么等问题，最终了解家蚕抗性性状形成的主要遗传机制。3性别决定和发育是家蚕另外两个重要的性状，它们决定产业的结构和效益。性别和发育的改良途径是进行人为的干预和调节，因此研究的关键是寻找鉴定靶基因。对于性别决定而言，其靶基因必须符合两个基本条件：一是处于调控网络的上游，才能实现彻底的性 别调节；二是雌为有功能而雄为无功能形式，才能满足基因干涉的需要。这就需要回答家蚕性别决定关键基因是什么和相互关系是什么，在此基础上，重点确定性别网络上游的，雌为有功能形式和雄为无功能形式的特异基因。对于家蚕 变态发育而言，涉及的基因数量多，克隆也相 对容易，但是研究表明，大多数基因的干涉将会造成蛹死亡，或者影响其他发育进程的顺利进行。因此， 发育调节靶基因也必须符合两个基本要求：一是处于调控网络的上游，二是必须具有严格的 时期特异性。激素和激素受体基因处于整个调控网络的最顶端，是项目要研究的重点对象。要解决的基本问题是参与蛹到蛾变态的激素和受体基因有哪些，作用方式和特征是什么等。 12 利用功能基因创造新型素材如何利用功能基因涉及两个关键科学问题和两个技术层次。两个关键问题是：一为以与产业密切相关的主要经济性状分子机理研究为基础，针对目前家蚕品种在产量和质量上的主要缺陷，影响结构效益的产业发展的主要限制因素，对家蚕经济性状进行分子改良；二是创造性地利用家蚕蛋白质合成能力，建立丝腺生物反应器，生产高附加 值的生物工程和医药产品。要完成上述问题，在技术上分两个层次进行：首先建立转基因家蚕技术，解决知识产权和效率问题；其次是通过对目标基因进行分子改良，解决面向实用品种的遗传素材创新问题。围绕以上关键问题，计划从四个方面开展研究：4(1)精细图谱构建、图谱整合和基因定位技术研究为解决基因分离和功能鉴定的规模和效率问题，在家蚕基因组框架图的基础上，重点开展以下几方面的研究：通过对现有家蚕基因组序列信息资源的整合，统一拼接组装，增加序列图谱的覆盖，充分利用已有 EST 和全长 cDNA 资源，完善基因组注释，构建精细图谱；在目前已有表达信息的基础上，研究关 键发育时期和组织的 SAGE 分析，建立系统的家蚕基因表达图谱和数据库；构建并整合分子连锁图谱和经典遗传图谱；重点开展基于遗传图谱的基因定位技术研究，并利用遗传资源（突 变系统）对重要基因进行定位。(2)重要基因的功能鉴定与分子机理研究解决关键基因的功能鉴定、阐明重要经济性状的遗传调控机理是项目的核心。通过 基因组序列分析，我们已经初步确定了丝蛋白 质结构基因调控领域和相关物质代谢基因，变态发 育过程中的激素和受体基因，与微生物抵抗相关的抗菌肽基因和以 Fem 和 Bmdsx 为中心的性别信号传导基因等一系列重要的功能基因。重点对上述关键开展以下几方面的研究： 基因的完整序列和结构（包括全长基因组序列、全长 cDNA 序列），表达特征，基因 结构多态性， 调控方式和调节因子，对重要性状的影响和在基因互作网络中的地位和作用，小分子mRNA、小 肽功能，病原体（如 NPV）与宿主细胞相互作用分子机理研究，遗传调节（低表达或基因敲除，超表达或者功能获得）的生物学效应，在转基因家蚕中的应用基础等。总体上讲 ，通 过研究，本 项目将阐 明家蚕重要经济性状的分子基础，拓展家蚕生物学基础 理论，探索大幅度提高蚕茧品质和行业整体效益的新途径。5(3)蛋白质图谱 构建和重要蛋白质鉴定主要目的是解决家蚕 DNA 序列与功能进一步联系和功能基础数据积累的问题，重点开展以下几方面的研究：建立主要发育时期以及不同组织器官的蛋白质标准图谱；利用蛋白质组学技术鉴定与主要经济性状相关的蛋白质，重点开展比较蛋白质组学研究，研究主要蛋白质时空变化；探索性地研究蛋白质后翻译修饰加工以及其对蛋白质功能的影响；建立家蚕主要蛋白质数据库。(4)基因组应用基 础和应用领域拓展研究主要目的是解决基因功能的生物学验证和产业应用问题，重点开展以下研究：研究高效、规模化转基因家蚕技术体系；克隆能满足各种基因定位表达需要的特异启动子，研究外来基因的表达控制；通过转基因和基因工程验证关键基因功能；研究建立基于基因工程的家蚕经济性状分子改良技术；创造新型的遗传素材。重点开展家蚕丝腺作 为生物反应器研究，解决基础载体构建、 转基因系建立、研究蛋白质表达效率的影响因素和提高技术；探索外源蛋白质纯化技术基础。二、预期目标61. 总体目标 项目总体目标是通过开展家蚕功能基因组研究保持我国蚕丝业的可持续发展，改变产业结构提高效益 为解决“三农”问题服务，并带动我国蚕学和昆虫学的长远发展。具体科学目标 主要是：充分发挥已绘制成功的家蚕全基因组序列框架图优势，加强后续研究力度，进一步确立和巩固我国家蚕功能基因组研究在国际上的地位；综合利用基因组和功能基因组研究的最新手段，通过对家蚕重要经济性状相关的功能基因的研究，在理论上基本阐明家蚕绢丝蛋白质合成、发育变态、免疫与微生物抵抗性等重要性状的遗传机理；在技术上建立包括基因定位、蛋白质组学研究和 转基因工程的核心体系，在确定关键可利用基因的基础上， 针对我国蚕丝产业 急需解决的问题， 创造新型素材；建立家蚕昆虫工厂的基础体系，拓展家蚕基因 组的应用领域。 为蚕桑学科培养和造就一批富有创新力，具有国际影响的中青年学术带头人和技术骨干。2. 五年预期目标（1） 构建四个体系，一是以基因组精细图谱、基因表达图谱、 遗传图谱和遗传资源分析等为基础的家蚕重要功能基因定位克隆体系；二是建立以蛋白质组学、基因功能获得和丧失以及分子生物学技术为主体的家蚕基因功能研究确认体系；三是建立以转基因蚕、基因干涉和基因改造等基因工程等技术为主体的家蚕重要功能基因应用体系和素材创新体系；四是建立家蚕生物工厂的基础体系。（2）分离克隆 200 个控制家蚕绢丝蛋白质合成、家蚕发育变态、家蚕免疫和微生物抵抗性等重要经济性状的候选功能基因，对其中 15 个关键基因进行重7点研究，弄清其结构和表达特征、生理生化功能、 调 控因子和调控方式，以及基因间的相互作用关系和生物学意义；探索其中 10 个功能基因转基因操作或者改造方法。（3）建立 20 个主要时期和不同组织器官的高丰度蛋白质图谱，质谱鉴定3000 个以上的蛋白质；获得家蚕主要蛋白质组织特异性表达以及翻译后修饰加工的初步信息，建立家蚕蛋白质组学数据库。建立家蚕小分子 mRNA、特别是小活性多肽库，初步完成 13 个具有重要价值的功能性蛋白。（4）阐明四个机理，初步阐明家蚕绢丝腺中丝蛋白质高效合成的分子机理，阐明家蚕蛹变态的分子机理， 阐明家蚕主要免疫分子基础和对微生物抵抗性的分子机理；阐明家蚕性别决定的遗传机制。（5）创造四个类型的新型遗传素材，通过转基因等基因操作技术，探索创造外源基因在家蚕丝腺特异表达的遗传素材、家蚕“永久蛹 ”遗传素材、高抗性素材和性别调控（雄蚕化）素材，每一个类型将分别创建 13 个具体的遗传素材；在素材的基础上将探讨获得新型品种，对成熟的品种进行实用化研究。（6）出版专著 24 部，获基因专利 10 个， 在国内外核心刊物发表论文250300 篇，其中有重要影响的论文 50 篇以上，并发表 23 篇有重要理论突破的高水平研究论文；培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次的科技新人，其中包括硕士研究生 200 名、博士研究生 100 名和博士后 15 名。三、研究方案81总体研究思路本项目的总体思路是：将家蚕全基因组工作框架图、家蚕功能基因注释信息和家蚕资源作为整个项目的基本出发点，综合运用基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学和分子生物学的方法和技术，通过从框架图到精细图谱到基因定位研究和从基因到功能到相互作用研究，克隆家蚕丝蛋白合成、性别、免疫和发育变态的关键 基因， 鉴定其功能， 阐明其主要机理。通过从基因到素材创新研究，实现重要经济 性状的遗传调节和改造，奠定产业实际应用的基础。2技术路线针对不同的目标基因，制定不同的技术路线：对于丝蛋白合成和抗性相关基因，由于研究重点在基因的相互作用和机理，因此主要技术路线是通过比较基因组学和生物信息鉴定网络中的关键节点基因，通过基因的调控领域分析研究基因的相互作用。而对于性 别决定和发育变态相关基因，重点是实现人为干预和遗传调控，因此主要技 术路线是通过基因表达特征和功能研究，确定符合调控要求的目标靶基因。基因的功能鉴定是整个项目的关键，总体上将利用基因表达谱分析、蛋白质组学、 转基因和基因干涉等技术， 对相关数据进行 综合分析，以提高分析效率。具体采用以下三条技术路线：（1）在已有工作基础上，从家蚕基因结构信息的解析到基因表达特性分析。将主要通过对家蚕基因组信息的深层次分析研究，结合 cDNA 文库的构建、大规模 EST 测序和基因表达分析，达到研究家蚕功能基因的 结构信息和表达特征9目的。（2）利用蛋白质组、遗传图谱和转基因等基因功能的高效研究手段，准确地分析研究目标基因的功能。（3）从我国丰富的家蚕遗传资源的分析到重要家蚕功能基因的分离，包括两个主要方面：一是对基因转录的时空特异性进行分析，研究功能基因表达与家蚕发育变态、性别和品质 形成的关系；二是通过家蚕物理图谱、分子图谱的构建，利用家蚕重要遗传突变 体和近等位基因系，定位克隆家蚕重要功能基因。充分利用近缘昆虫如果蝇的基因组信息，通过比较基因组研究也是本研究技术路线的重要组成部分。总体技术路线示意如下：基因相互作用鳞翅目害虫特异基因遗传图谱 精细图谱素材创新产业技术进步 生物医药丝蛋白合成、性别、免疫与发育功能基因克隆整合图谱转基因、干涉蛋白质产物基因功能与性状的遗传机理遗传资源 框架图生物工厂比较基因组103创新性（1）本项目不仅是家蚕，也是鳞翅目昆虫领域基因组的第一个重大科技行动。项目基于我国的特殊资 源优势和强大产业需求，将家蚕重要功能基因和其产业应用作为主要目标，因此与国际家蚕基因组和功能基因组研究计划相比，更加注重产业化应用导向。 项目所重点涉及的家蚕性别决定、发育和变态、重要经济性状形成的分子机理研究等内容，在理论上属于前沿和开拓性课题，应用上切中我国蚕丝业质量和效益要害，因此与蚕丝产业技术传统研究相比，具有理论上的先进性和技术方案的高效性。项目集中体现了基础研究