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XXXX 大学毕业设计（论文）- 1 -第一章 绪论本章主要介绍显微镜发展过程及研究意义，及本文主要工作。1.1 显微镜发展过程及研究意义本章主要介绍了显微镜的历史发展过程及研究意义。1.1.1 显微镜的历史发展显 微 镜 是 人 类 这 个 时 期 最 伟 大 的 发 明 物 之 一 。 在 它 发 明 出 来 之 前 ， 人 类关 于 周 围 世 界 的 观 念 局 限 在 用 肉 眼 ， 或 者 靠 手 持 透 镜 帮 助 肉 眼 所 看 到 的 东 西 。显 微 镜 把 一 个 全 新 的 世 界 展 现 在 人 类 的 视 野 里 。 人 们 第 一 次 看 到 了 数 以 百 计的 “新 的 ”微 小 动 物 和 植 物 ， 以 及 从 人 体 到 植 物 纤 维 等 各 种 东 西 的 内 部 构 造 。最 早 的 显 微 镜 是 16 世 纪 末 期 在 荷 兰 制 造 出 来 的 。 发 明 者 可 能 是 一 个 叫做 札 恰 里 亚 斯 詹 森 的 荷 兰 眼 镜 商 ， 或 者 另 一 位 荷 兰 科 学 家 汉 斯 -利 铂 希 ，他 们 用 两 片 透 镜 制 作 了 简 易 的 显 微 镜 ， 但 并 没 有 用 这 些 仪 器 做 过 任 何 重 要 的观 察 。后 来 有 两 个 人 开 始 在 科 学 上 使 用 显 微 镜 。 第 一 个 是 意 大 利 科 学 家 伽 利 略 。他 通 过 显 微 镜 观 察 到 一 种 昆 虫 后 ， 第 一 次 对 它 的 复 眼 进 行 了 描 述 。 第 二 个 是荷 兰 亚 麻 织 品 商 人 安 东 尼 凡 列 文 虎 克 （ 1632 年 -1723 年 ） ， 他 自 己 学会 了 磨 制 透 镜 。 他 第 一 次 描 述 了 许 多 肉 眼 所 看 不 见 的 微 小 植 物 和 动 物 。1931 年，恩斯特鲁斯卡通过研制电子显微镜，使生物学发生了一场革命。这使得科学家能观察到像百万分之一毫米那样小的物体。1986 年他被授予诺贝尔奖。扫 描 探 针 显 微 镜 (SPM)经 过 近 30 年 的 发 展 ， 已 经 应 用 到 科 学 研 究 的 各 个方 面 。为 适 应 不 同 研 究 的 需 要 ， 扫 描 探 针 显 微 镜 本 身 的 发 展 也 非 常 迅 速 。 如 其 中 原 子 力 显 微 镜 （ A F M ) 从 发 明 初 期 的 单 一 的 接 触 工 作 模 式 发 展 到包 括 可 以 测 量 粘 弹 性 的 相 位 模 式 在 内 的 多 种 工 作 模 式 ， 同 时 通 用 型 方 面也 高 度 发 展 ， 已 经 形 成 了 一 个 庞 大 的 高 度 自 动 化 的 扫 描 探 针 显 微 镜 的 家族 。 在 这 个 家 族 中 ， 严 格 环 境 控 制 的 扫 描 探 针 显 微 镜 的 出 现 ， 很 好 的 解决 了 各 种 条 件 下 对 样 品 的 原 位 观 察 ， 环 控 化 扫 描 探 针 显 微 镜 的 发 展 已 经 引XXXX 大学毕业设计（论文）- 2 -起 了 人 们 的 足 够 重 视 ， 必 将 成 为 扫 描 探 针 显 微 镜 发 展 的 一 个 重 要 方 向 。 新 近 出 现 的 各 种 显 微 镜 集 成 的 扫 描 探 针 显 微 镜 系 列 是 这 个 家 族 中 的 新 成 员 ， 这 个 成 员 可 以 同 时 完 成 大 范 围 、 高 分 辨 和 精 确 定 位 等 各 种 研 究 ， 必 将 在半 导 体 制 造 厂 的 异 物 检 查 、 金 属 和 绝 缘 体 等 表 面 测 定 以 及 生 物 大 分 子 研 究 等领 域 发 挥 重 要 作 用 。 扫 描 探 针 显 微 镜 的 发 明 和 发 展 促 进 了 一 门 新 兴 的 高 科技 纳 米 科 学 技 术 的 诞 生 ， 宣 告 一 个 科 技 新 纪 元 ， 纳 米 科 技 时 代 已 经来 临 。 1.1.2 显 微 镜 研 究 的 意 义多少年来，人们为提高显微镜的分辨能力和成像衬度付出了艰辛的劳动，随着计算机技术和工具的不断进步，光学设计的理论和方法也在不断改进，加上原材料性能的提高，工艺和检测手段的不断完善，观察方法的创新，使光学显微镜的成像质量已经接近衍射极限的完善程度，人们将用标本染色、暗场、相衬、荧光、干涉、偏光等观察技术，使得光学显微镜已能适应形形色色标本的研究，虽然近年来电子显微镜，超声显微镜等放大成像仪器先后问世，在某些方面具有优势的性能，但在廉价、方便、直观、特别是适合生物活体的研究等方面仍无法与光学显微镜匹敌，光学显微镜仍然牢固地占据着自己的阵地。另一方面，与激光、计算机、新材料技术、信息技术相结合，古老的光学显微镜正焕发青春，显示了旺盛的生命力，数码显微镜、激光共焦扫描显微镜、近场扫描显微镜、双光子显微镜及具有各种新的功能或能适应各种新的环境条件的仪器层出不穷，更加扩大了光学显微镜的应用领域，作为最新的例子。从火星探测车上传回的岩层显微图片是多么令人振奋！我们完全可以相信，光学显微镜将会以更新的姿态，造福人类。 由于近场光学显微镜能克服传统光学显微镜低分辨率以及扫描电子显微镜和扫描隧道显微镜对生物样品产生损伤等缺点，因此得到了越来越广泛的应用，特别是在生物医学以及纳米材料和微电子学等领域。 高分辨率光学成像由于近场光学显微镜对所观察的生物样品无损伤等优点，因此被广泛应用于生物样品的观察，成为探索生物大分子活动奥秘的光学手段，给生物学家们带来强有力的实验武器。利用近场光学显微镜，已在生物学研究所涉及的许多领域展开了工作，不仅有静态的形貌像的观察研究，如细胞的有丝分裂，染色体的分辨与XXXX 大学毕业设计（论文）- 3 -局域荧光，原位 DNA，RNA 的测序，基因识别等，还有利用观察形貌像随时间变化的动力学过程的研究。 自从1933年德国 Ruska 和 Knoll 等人在柏林制成第一台电子显微镜后，几十年来，有许多用于表面结构分析的现代仪器先后问世。如透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、场电子显微镜（FEM ）、场离子显微镜（FIM）、低能电子衍射（LEED）、俄歇 谱仪（AES）、光电子能谱（ESCA）、电子探针等。这些技术在表面科学各领域的研究中起着重要的作用。扫描电镜是一种多功能的仪器、具有很多优越的性能、是用途最为广泛的一种仪器早期的透射电子显微镜功能主要是观察样品形貌，后来发展到可以通过电子衍射原位分析样品的晶体结构。具有能将形貌和晶体结构原位观察的两个功能是其它结构分析仪器所不具备的。1.2 本文主要工作本文主要通过对电子显微镜及扫描探针显微镜结构和原理的研究，能够让大家了解这两种显微镜技术的物理原理及其应用。XXXX 大学毕业设计（论文）- 4 -第二章 光学显微镜本章简单介绍了光学显微镜的各种情况。2.1 光学显微镜简介光学显微镜俗称光镜，是一种以可见光为照明光源的显微镜。光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。目前主要应用于细胞生物学方面。光学显微镜一般由载物台、聚光照明系统、物镜，目镜和调焦机构组成。载物台用于承放被观察的物体。利用调焦旋钮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，使被观察物体调焦清晰成象。聚光照明系统由灯源和聚光镜构成，聚光镜的功能是使更多的光能集中到被观察的部位。照明灯的光谱特性必须与显微镜的接收器的工作波段相适应。物镜位于被观察物体附近，是实现第一级放大的镜头。在物镜转换器上同时装着几个不同放大倍率的物镜，转动转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路，物镜的放大倍率通常为 5100 倍。物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件，一般变倍比为 6.3：1，变倍范围 0.8X-5X。常用的有能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜；质量更高的还有能对三种色光校正色差的复消色差物镜；能保证物镜的整个像面为平面，以提高视场边缘成像质量的平像场物镜。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为 1.5 左右的液体，它能显著的提高显微观察的分辨率。目镜是位于人眼附近实现第二级放大的镜头，镜放大倍率通常为 520 倍。目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦，获得清晰的图像。用高倍物镜工作时，容许的调焦范围往往小于微米，所以显微镜必须具备极为精密的微动调焦机构。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率，显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。 分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到XXXX 大学毕业设计（论文）- 5 -2.1 光学显微镜结构的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响，但又是易于被使用者忽视的环节。它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明。聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角，否则就不能充分利用物镜所能达到的最高分辨率。为此目的，在聚光镜中设有类似照相物镜中的，可以调节开孔大小的可变孔径光阑，用来调节照明光束孔径，以与物镜孔径角匹配。改变照明方式，可以获得亮背景上的暗物点(称亮视场照明)或暗背景上的亮物点(称暗视场照明)等不同的观察方式，以便在不同情况下更好地发现和观察微细结构。XXXX 大学毕业设计（论文）- 6 -2.2 光学显微镜的发展历史早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590 年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610 年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。16731677 年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。 19 世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827 年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19 世纪 70 年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为 19 世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850 年出现了偏光显微术；1893 年出现了干涉显微术；1935 年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在 1953 年获得了诺贝尔物理学奖。古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄像装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。近代的光学显微镜通常采用两级放大，分别由物镜和目镜完成。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大，成一虚像，人眼看到的就是虚像。而显微镜的总放大倍率就是物镜放XXXX 大学毕业设计（论文）- 7 -大倍率和目镜放大倍率的乘积。放大倍率是指直线尺寸的放大比，而不是面积比。2.2 光 学 显 微 镜2.3 光学显微镜的工作原理显微镜是利用凸透镜的放大成像原理，将人眼不能分辨的微小物体放大到人眼能分辨的尺寸，其主要是增大近处微小物体对眼睛的张角（视角大的物体在视网膜上成像大），用角放大率 M 表示它们的放大本领。因同一件物体对眼睛的张角与物体离眼睛的距离有关，所以一般规定像离眼睛距离为 25 厘米（明视距离）处的放大率为仪器的放大率。显微镜观察物体时通常视角甚小，因此视角之比可用其正切之比代替。 显微镜由两个会聚透镜组成，光路图如图所示。物体 AB 经物镜成放大倒立的实像 A1B1，A1B1 位于目镜的物方焦距的内侧，经目镜后成放大的虚像 A2B2于明视距离处。XXXX 大学毕业设计（论文）- 8 -2.3 光学显微镜放大原理光路图第三章 电子显微镜本章重点介绍电子显微镜的物理原理及应用。3.1 扫描电子显微镜本节着重介绍电子显微镜中的扫描电子显微镜。3.1.1 扫描电子显微镜简介扫描电镜一种新型的电子光学仪器。它是利用细聚焦电子束在样品表面扫描时激发出来的各种物理信号来调制成像的。它具有制样简单、放大倍数可调范围宽、图像的分辨率高、景深大等特点。数十年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、冶金学等学科的领域中，促进了各有关学科的发展。扫描电子显微镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。扫描电子显微镜的制造是依据电子与物质的相互作用。当一束高能的入射电子轰击物质表面时，被激发的区域将产生二次电子、俄歇电子、特征 X 射线和连续谱 X 射线、背散射电子、透射电子，以及在可见、紫外、红外光区域产生的电子辐射。同时，也可产生电子-空穴对、晶格振动 (声子)、电子振荡 (等离子体)。原则上讲，利用电子和物质的相互作用，可以获取被测样品本身的各种物理、化学性质的信息，如形貌、组成、晶体结构、电子结构和内部电场或磁场等等。扫描电子显微镜正是根据上述不同信息产生的机理，采用不同的信息检测器，使选择检测得以实现。如对二次电子、背散射电子的采集，可得到有关物质微观形貌的信息;对 x 射线的采集，可得到物质化学成分的信息。正因如此，根据不同需求，可制造出功能配置不同的扫描电子显微镜。XXXX 大学毕业设计（论文）- 9 -3.1 扫描电子显微镜3.1.2 扫描电镜发展历史1923年，法国科学家 Louis de Broglie 发现，微观粒子本身除具有粒子特性以外还具有波动性。他指出不仅光具有波粒二象性，一切电磁波和微观运动物质(电子、质子等)也都具有波粒二象性。电磁波在空间的传播是一个电场与磁场交替转换向前传递的过程。电子在高速运动时，其波长远比光波要短得多，于是人们就想到是不是可以用电子束代替光波来实现成像。1926年，德国物理学家 HBusch 提出了关于电子在磁场中的运动理论。他指出：具有轴对称性的磁场对电子束来说起着透镜的作用。从理论上设想了可利用磁场作为电子透镜，达到使电子束会聚或发散的目的。有了上述两方面的理论，1932年，德国柏林工科大学高压实验室的M.Knoll 和 E.Ruska 研制成功了第1台实验室电子显微镜，这是后来透射式电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）的雏形。其加速电压为XXXX 大学毕业设计（论文）- 10 -70kV，放大率仅12倍。尽管这样的放大率还微不足道，但它有力地证明了使用电子束和电磁透镜可形成与光学影像相似的电子影像。这为以后电子显微镜的制造研究和提高奠定了基础。1933年，E.Ruska 用电镜获得了金箔和纤维的1万倍的放大像。至此，电镜的放大率已超过了光镜，但是对显微镜有着决定意义的分辨率，这时还只刚刚达到光镜的水平。1937年，柏林工业大学的 Klaus 和 Mill 继承了 Ruska 的工作，拍出了第1