清华大学毕业学位论文上转换荧光高分辨率在体成像技术及应用研究VIP

上转换荧光高分辨率在体成像技术及应用研究(申 请 清 华 大 学 工 学 硕 士 学 位 论 文 )培 养 单 位 ：医 学 院学 科 ：生 物 医 学 工 程研 究 生 ： 指 导 教 师 : 教 授二 一 三 年 五 月高分辨率上转换荧光在体成像技术及应用研究黎新Research of Upconversion Fluorescence High Resolution in vivo Imaging and Its ApplicationThesis Submitted toTsinghua Universityin partial fulfillment of the requirement for the degree of Master of ScienceinBiomedical EngineeringbyLi XinThesis Supervisor: Professor Huang GuoliangMay, 2013关于学位论文使用授权的说明本人完全了解清华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：清华大学拥有在著作权法规定范围内学位论文的使用权，其中包括：（1）已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文；（2）为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所供校内师生阅读，或在校园网上供校内师生浏览部分内容。本人保证遵守上述规定。（保密的论文在解密后遵守此规定）作者签名： 导师签名： 日 期： 日 期： 摘 要I摘 要自 二 十 世 纪 末 以 来 ， 荧 光 在 体 成 像 技 术 由 于 具 有 高 灵 敏 度 、 无 辐 射 伤 害 、多 通 道 并 行 检 测 、 低 仪 器 成 本 等 优 点 ， 得 到 了 迅 速 的 发 展 ， 目 前 已 成 为 药 物 开发 、 肿 瘤 诊 断 、 疾 病 监 测 等 必 不 可 少 的 工 具 。 然 而 ， 光 子 在 生 物 组 织 中 发 生 较强 的 散 射 ， 导 致 成 像 分 辨 率 降 低 ； 另 外 ， 目 前 多 通 道 检 测 主 要 依 靠 光 谱 分 离 技术 将 不 同 靶 标 的 荧 光 信 号 区 分 开 来 ， 这 种 技 术 产 生 的 光 谱 混 叠 问 题 限制了通 道 的 数 量 （ 5 通 道 ） ， 具 有 局 限 性 。 若 解 决 好 了 上 述 两 个 问 题 ， 将 可 以拓 展 荧 光 在 体 成 像 技 术 的 应 用 范 围 。本 研 究 构 建 了 基 于 UNPs 的 高 灵 敏 度 (0.9310-4 wt%)、 高 分 辨 率 (50 m)在 体 成 像 平 台 ， 在 该 平 台 上 实 现 了 微 阵 列 生 物 芯 片 （ 样 点 尺 寸 ： 2525 m） 的 在 体 检 测 。 论 文 主 要 工 作 如 下 ：首 先 ， 利 用 有 限 元 方 法 对 上 转 换 荧 光 在 散 射 介 质 中 的 传 播 进 行 了 模 拟 仿真 。 仿 真 发 现 ， UNPs 对 其 位 置 信 息 更 为 敏 感 ， 利 用 UNPs 有 望 实 现 更 高定 位 精 度 与 更 高 分 辨 率 的 在 体 成 像 。其 次 ， 构 建 了 基 于 UNPs 的 在 体 成 像 硬 件 平 台 ， 并 开 发 了 集 仪 器 运 动 控制 、 图 像 采 集 分 析 、 实 时 显 示 于 一 体 的 配 套 软 件 。 制 备 了 组 织 仿 体 ， 利 用其 对 平 台 的 灵 敏 度 、 空 间 分 辨 率 等 性 能 指 标 进 行 了 评 估 。 基 于 仿 体 的 研 究证 明 ， 平 台 对 于 皮 下 上 转 换 荧 光 检 测 的 灵 敏 度 为 0.9310-4 wt%， 空 间 分 辨率 达 到 100 m。再 次 ， 设 计 和 制 备 了 用 于 高 分 辨 率 在 体 成 像 的 可 行 性 验 证 的 UNP 微 阵列 芯 片 （ 样 点 尺 寸 ： 2525 m， 5050 m， 100100 m； 中 心 距 ： 50 50 m, 100 100 m, 200 200 m） 。 实 验 结 果 表 明 ： 皮 肤 经 光 透 明 剂 （ 聚 乙二 醇 -400 与 噻 酮 混 合 液 ） 处 理 后 ， 平 台 能 分 辨 的 皮 下 最 小 荧 光 样 点 尺 寸 从5050 m 降 低 至 2525 m。最 后 ， 将 2525 m 的 芯 片 包 埋 于 活 体 小 鼠 皮 下 ， 利 用 构 建 的 平 台 进 行在 体 成 像 ， 获 得 了 清 晰 分 辨 的 点 阵 图 。 实 验 结 果 证 明 ： 利 用 本 平 台 技 术 ， 可实 现 样 点 尺 寸 2525 m 微 阵 列 芯 片 在 体 成 像 检 测 。利 用 本 论 文 构 建 的 高 灵 敏 度 、 高 分 辨 率 的 上 转 换 荧 光 在 体 成 像 系 统 ，结 合 微 阵 列 芯 片 技 术 ， 可 以 发 展 成 为 一 种 高 通 量 在 体 成 像 检 测 平 台 技 术 ， 实 现多 种 生 物 标 记 物 在 体 成 像 并 行 检 测 ， 在 生 物 医 学 领 域 具 有 重 要 的 应 用 价 值 。关 键 词 ：在 体 成 像 ； 上 转 换 荧 光 ； 微 阵 列 芯 片 ； 高 分 辨 率 ； 高 通 量 AbstractIIAbstractDue to the advantages of high sensitivity, no radiation damage, multi-channel parallel detection and low cost, in vivo fluorescence imaging has got rapid developments in both technology and application since the end of the twentieth century, and has become an indispensable tool for various biomedical researches, such as drug development, cancer diagnostic, disease monitoring and so on. However, strong scattering of photons in biological tissue results in the decrease of imaging resolution. Whats more, multi-channel detection mainly depends on spectral unmixing technique to distinguish different fluorescence probes. Limited detection spectral bandwidth (usually visible to NIR waveband) and the bandwidth consumption by each emission fluorescence will confine channel numbers (5 or less channels) in simultaneous multicolor detection. Both of the above two problems limit the application ranges of in vivo fluorescence imaging technology.In this study, an in vivo imaging system using UNPs and microarray was constructed with high sensitivity (0.93 x 10-4 wt %)and high resolution (50 m). In vivo detection of UNP microarray (spot size: 25 25 m) was realized using this system. The paper mainly includes the following four parts:First of all, simulations for upconversion fluorescence transports in scattering media were conducted by using the finite element method (FEM). It was found that as the embedding depth increased, the surface UNPs fluorescence changed more than that of ordinary fluorescent materials. This phenomenon shows that UNPs are more sensitive to the location information and in vivo fluorescence tomography with higher precision positioning and higher resolution may be achieved by using UNPs as contrast.Secondly, the hardware platform for in vivo imaging based on UNPs was built and the software was developed which set instrument motion control, image collection, analysis and real-time display in one. At the same time, tissue phantoms were prepared and used to evaluate the sensitivity, spatial resolution of the system. Phantom studies demonstrate that the sensitivity and the spatial resolution for subcutaneous UNPs detection are 0.9310-4 wt% and 100 m, respectively.Thirdly, three kinds of UNP microarrays (spot sizes: 25 25 m, 50 50 m, 100 AbstractIII 100 m, center distances: 50 50 m, 100 100 m, 200 200 m) were designed and prepared to validate the feasibility of in vivo detection of the UNP microarrays. To reduce the scattering coefficient of skin and improve the spatial resolution, the optical clearing agent (mixture of polyethylene glycol-400 and Thiazone) was locally applied on the skin of living nude mouse. The skin of interest before and after treated were excised and used to covered the UNP microarrays respectively, then the skin-covered microarrays were detected by using the proposed system. The experimental results show that after transparent processing, the microarray with smaller spot size of 25 25m could be resolved.Finally, microarray with 2525m spots was embedded under the skin of living nude mouse. Detecting by using the proposed system, clearly resolved microarray images were obtained. The experimental results prove the feasibility of microarray in vivo detection.The in vivo imaging system using UNPs with high sensitivity and high resolution built in the paper, combining with the technology of microarrays with specific probe spotting, may be used as an in vivo imaging platform for multi-biomarkers high throughput detection in biomedical engineering researches in future.Key words: in vivo imaging; upconversion fluorescence; microarray; high resolution; high throughput目 录IV目 录第 1 章 引言.11.1 小动物在体成像技术概述.11.1.1 小动物在体成像技术及其分类.11.1.2 荧光在体成像技术及其分类.21.2 连续荧光在体成像技术的特点与研究进展.41.2.1 连续荧光在体成像技术的特点.41.2.2 连续荧光在体成像技术国内外研究进展.51.2.3 荧光在体成像商业化仪器.91.2.4 连续荧光在体成像技术的发展趋势.101.3 多靶标荧光在体成像技术研究进展.101.4 基于 UNPs 的在体成像技术研究进展 .111.4.1 荧光探针的发展.111.4.2 上转换纳米荧光材料的发光机制与特点.121.4.3 UNPs 在荧光在体成像中的应用 .121.5 生物芯片概述.141.6 本文研究的目的和意义.151.7 本文各章节的介绍.16第 2 章 UNPs 荧光传输特性研究与制备 .182.1 光子在生物组织中传输的数学模型.182.1.1 生物组织中光子传输的数学模型.182.1.2 MC 模拟 .182.1.3 扩散方程.192.1.4 扩散方程的求解.202.2 UNPs 荧光在生物组织中传播的仿真 .212.2.1 UNPs 荧光在生物组织中传播的研究现状 .212.2.2 仿真软件与实验步骤.212.2.3 UNPs 荧光传输仿真与特性研究 .242.2.4 实际小鼠三维几何模型中上转换荧光的传输仿真.252.3 UNPs 的制备与评估 .28目 录V2.3.1 UNPs 的制备 .282.3.2 NaYF4:Yb,Er 纳米颗粒的形态测量 .282.3.3 NaYF4:Yb,Er UNPs 荧光光谱测量 .292.3.4 NaYF4:Yb,Er 纳米颗粒荧光强度与激发光功率的关系 .312.4 本章小结.32第 3 章 上转换荧光在体成像系统构建与性能评估.333.1 系统整体规划设计.333.2 硬件平台的搭建.343.2.1 硬件平台的需求分析.343.2.2 硬件平台的搭建.343.3 系统软件的开发.363.3.1 软件的面向对象设计需求分析.363.3.2 系统软件开发与测试.383.4 组织仿体的制备.413.4.1 组织仿体材料的选取与配制.413.4.2 仿体的制备步骤.443.4.3 方形仿体的上转换荧光检测.453.5 系统滤光片组的优化.483.6 仪器检测