人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析PPT课件

人类基因组 DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析2 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 2 第一节 实验目的 掌握人类基因组 DNA提取的基本原理和方法 掌握琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA方法3 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 3 第二节 实验原理4 相关 知识核酸提取思路：q 破膜：细胞膜、核膜 q 分离：通过酶，有机溶剂，调节 pH值，离心等q 纯化：去除杂质5 DNA提取原则：q 保证 DNA一级结构的完整性q 排除其他分子的污染，使其纯度尽可能高排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染相关 知识6 样品来源：q 培养细胞q 组织标本q 血液样本相关 知识7 实验 原理用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入 SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从 DNA上解离下来，经苯酚 氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀 DNA， 75%乙醇洗涤 DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的 DNA。本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶 K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附 DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组 DNA。8 第一节实验原理离心吸附柱内的 硅基质膜 在 高盐，低 pH值状态下选择性地结合溶液中的 DNA，再通过漂洗液将杂质去除，最后 低盐，高 pH值的洗脱缓冲液 或去离子水将 DNA从硅基质膜上 洗脱 。高盐，低 pH值 ：选择性 结合DNA 漂洗低盐，高 pH值 ：DNA从硅基质膜上 洗脱9 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 9 第三节 主要试剂10 主要试剂q 培养细胞q RNase A（ 100mg/ml）q ProteaseqBuffer GRq Buffer GLq 无水乙醇q Buffer GW1q Buffer GW2q Buffer GE11 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 11 第四节 主要仪器12 微量移液器 台式微量离心机电泳仪 凝胶成像系统主要仪器13 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 13 第五节 操作步骤14 LOGO1.样品处理：取 1管细胞，做好标记， 5000rpm离心 3分钟，弃上清，收集细胞。3.向以上溶液中加入 20 l Protease K，混匀。4.加入 200 l Buffer GL，颠倒混匀 15次，剧烈震荡至少 1分钟。注意：不要直接将 Protease直接加入到 Buffer GL。5. 56 孵育 10分钟，其间颠倒混匀数次6.加入 200 l 无水乙醇，颠倒混匀 10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上 的液体集中到管底。第五节操作步骤7.将步骤 5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分多次转入。 12,000 rpm离心 1分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。2.加入 200 l GR，用移液器反复吸打几次，使细胞悬浮。1415 LOGO10.吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入 60l Buffer GE ，室温放置 2分钟， 12,000 rpm离心 1分钟，收集 DNA溶液， -20 保存 DNA。7.向吸附柱中加入 500 l Buffer GW1， 12,000 rpm离心 1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中。8.向吸附柱中加入 500 l Buffer GW2， 12,000 rpm离心 1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。9.10,000 rpm离心 2分钟，倒收集管中的废液。吸附柱置室温 2分钟，以彻底晾干。第五节操作步骤11.取 5 -10l 基因组 DNA，并加入 2 l 上样缓冲液，混匀，加样到 1琼脂糖凝胶点样孔中，电泳检测分析。 1516 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 16 第六节 注意事项17 LOGO（ 1） 试剂配制及保存规范，离心管及 Tip头需经高压灭菌处理。（ 2） 基因组 DNA长而弯曲，易断裂。操作过程中 尽量轻缓 ，避免过度的溶液吹打转移，以及过高的温度。第六节注意事项1718 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 18 第七节 结果分析19 LOGO第七节结果分析量：越多越好。量越多电泳区带越明亮。质量：a. 纯度越纯越好。 A260/A280越接近 1.8越好b. 分子量越大越好。DNA分子量大于 30KB，可满足一般实验要求。 1.0的琼脂糖凝胶电泳，理想电泳结果 :靠近点样孔，落后于 Marker最后一条区带 (约 21KB)的位置可见一条明亮的区带。区带前方，不应有拖尾（降解），或较弥散的小分子量区带（ RNA）。1920 LOGOM: DNA/HindIII+EcoRI DNA Marker；1-5: 基因组 DNA基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图第七节结果分析21226 bpM 1 2 3 4 52021 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 21 课程相关资源22 LOGO课程简介课程简介医学分子生物学 -国家精品资源共享课 ， 2013（ 1:4505/）医学分子生物学 -国家精品课程 (本科