发根农杆菌介导的植物基因转化ppt演示课件

发根农杆菌介导的植物基因转化1.n 发根是发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes)感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，产生的一种形态上与植物气生根类似的根状器官 .发根（发根（ hairy root）是什么？）是什么？2.3.什么是发根农杆菌 ?发根农杆菌（发根农杆菌（ A. rhizogenes） 来自土壤来自土壤 , 呈棒呈棒 (杆杆 )状状 , 细胞质内有一种质粒细胞质内有一种质粒 (plasmid） , 叫诱根质粒（叫诱根质粒（root inducing plasmid） , 简称简称 Ri 质粒质粒 , 与发根的与发根的诱导有关诱导有关 . 发根农杆菌发根农杆菌 能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物植物 .4.Ri质粒5.Ri 质粒 T DNA区和 Vir 区的两个功能区 . T DNA叫可转移 DNA区 , 可插入到寄主植物基因组中，其中携带生根基因和冠瘿碱合成酶的基因 .Vir 称致病区 , 不插入到寄主植物基因组 DNA中，但与 T DNA的转移有关， Vir 区 缺失或突变则不能使感染的植物出现发根 发根农杆菌诱导发状根产生的原因发根农杆菌诱导发状根产生的原因 ?6.LBRBviroriABGCDEopinecatabolismHairy root genesand opine synthaseT-DNARi7.8.1. 发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特殊的小分子化合物，诱导 Ri 质粒的 Vir区基因群活化；2. 在 Vir区基因表达产生的酶作用下 T DNA被切下；3. T DNA转移进细胞并整合到植物基因组 DNA中；4. T DNA在细胞中转译，使宿主植物产生发根 Ri 质粒感染过程9.发状根的特点n 生长迅速n 激素自养n 分化程度高n 遗传性状稳定10.发根农杆菌感染植物的方法n 向植物体直接注射n 对植物外植体进行接种感染n 与原生质体共培养11.n 含抗生素的培养基上继代培养除菌n 选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养 n 增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根的生长 .n 一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙子发根每月增殖 2500 5000倍） 发根的筛选及增殖培养发根的筛选及增殖培养12.发根的鉴定n 形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝， 多根毛，无向地性 n 组织水平： GUS 活性的测定或 NPTII 酶的检测 n 细胞水平：冠瘿碱的测定 n 分子水平： Southern Blot, PCR等方法 13.影响发根农杆菌转化的因素 1. 菌株 : 常用菌株有 LBA9402，ATCC15834， R1601， TR105，A41027， A42659 等14.目前超过 100,000种化合物被从植物中鉴定，并以每年约 4000种新化合物的速度增加 .植物次生代谢物质大多具有生物活性，被用作医药品、化妆品、食品添加剂等植物是自然界中最好的化工厂15.16.植物次生代谢物的获得 直接从野生植株中分离提取 植物细胞培养优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域限制；不占用耕地 ; 缺点：植物细胞生长缓慢；次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化 植物发根培养17.n 对 Ri质粒的敏感性：双子叶植物 单子叶植物，草本植物 木本植物n 在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子叶柄、胚轴作为外植体 n 将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根诱导率的变化 2. 植物种及外植体的种类植物种及外植体的种类18.n 水溶性酚 ：乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚、对羟基苯酚 等，可激活 Vir区基因表达n 光照3. 理化因子的影响理化因子的影响19.感染前高渗处理、感染前高渗处理、诱导培养时添加生长素等诱导培养时添加生长素等4. 其它其它20.影响发根培养及次生代谢物合成的因素n 培养基： 基本培养基、碳源、氮源、 pH值等n 植物激素：发根能在无激素培养基上较好生长，但外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合成均有影响n 前体物质n 诱导子： 可刺激代谢物的产生和分泌21.5. 培养方法n 固体培养n 液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养n 两步培养法n 两相培养法n 反复成批培养n 补料成批培养6. 生物反应器n 发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要n 通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器22.23.发状根的用途n 遗传育种n 植物有用次生代谢产物工业化生 产24.丹参发根生物反应器大规模培养技术 丹参 (Salvia miltiorrhiza)是我国传统中药 ,具有活血化淤 ,通经止痛的功能 .丹参中含有二类活性成分 : 脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类化合物 .二萜醌类化合物 ,如丹参酮 I, 丹参酮IIA,隐丹参酮等 ,具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠状动脉供血等药理作用 ,是治疗心血管系统疾病的重要药物 .酚酸类化合物 ,如丹酚酸 A, 丹酚酸 B、紫草酸、迷迭香酸 , 原儿茶醛 , 丹参素等 ,具有很强的抗脂质氧化、抗肝纤维化、改善尿毒症、改善肾功能等作用。但是由于丹参有效成分在原植物根中含量低、生长周期长