fish技术在血液肿瘤中的应用

上海市第一人民医院Shanghai First Peoples Hospital上海市第一人民医院Shanghai First Peoples Hospital上海市第一人民医院 血液科Shanghai First Peoples Hospital荧光 原位杂交 （ FISH）在血液肿瘤中的应用FISH的定义荧光 原位杂交（ FISH） 是 20世纪八十年代在 细胞遗传学 、 分子遗传学 和 免疫学 相结合的基础上发展起来的新技术。它利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或先以生物素或地高辛等半抗原标记后与靶 DNA进行杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进行 定性 、 定位 和 定量分析 。FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH技术原理FISH的种类v间期 FISH（ Interphase FISH）v染色体涂染分析（ Chromosome painting）v多色 FISH（ Multicolor-FISH）v反向涂染（ Reverse painting）v比较基因组杂交（ Comparative genomic hybridization）FISH探针的种类和用途v 着丝粒探针用于检测 染色体数目异常 如三体、单体等。v 亚端粒探针靠近端粒的 200-300Kb为染色体特异性 DNA，用于检测涉及端粒的隐匿性易位 。v 染色体臂或整条染色体涂染探针（ WCP）用于检测染色体 易位 和 标记染色体 。v 序列特异性探针 包括臂、带和基因探针等多种，用于检测 基因缺失和重排 。血液肿瘤 FISH检测常见探针类型双色双融合探针（双色双融合探针（ DC， DF）额外信号探针（额外信号探针（ ES）分离探针（分离探针（ BRK）FISH在血液肿瘤中的应用检测样本可以是血液、骨髓、石蜡切片v诊断和鉴别诊断v治疗和预后分层v监测疗效（微小残留病灶检测） v识别移植后骨髓细胞来源一、诊断和鉴别诊断v核型 分析 缺点： 有丝分裂象少或缺如 染色体质量低劣，显带不佳 染色体异常复杂v分子生物学检测 不足： 常见的转录序列来设计引物，扩增的片段长度一般在 100 700bp之间 mRNA剪切方式比较特殊，假阴性结果，易造成漏诊或误诊一、诊断和鉴别诊断vFISH技术能弥补以上 2种技术的不足之处 间期细胞上分析（无需中期分裂象），极大地提高了敏感性、准确性和可靠性。 对核型提示的染色体异常做进一步鉴定，从 “ 正常核型 ” 中筛查隐匿的染色体畸变，成为精确的染色体分析不可缺少的手段。 FISH探针的片段相对较长，常可达数百 kb，甚至大于 1Mb，跨越融合基因每一侧多个外显子区域，只要发生在这些区域的缺失或易位都能被检测到，极少发生漏检，假阴性率很低。v举例v 男性 46岁 患者， 2003.2.24内科急诊发现白细胞增高（ 25 109/L） 。v 骨髓显示粒系极度增生，红系、巨核系以及血小板增生尚可， NAP积分 49分，核型分析结果为46,XY20。v 随访 3年 ， 其白细胞始终维持在 20-30 109水平。一、诊断v 2006.5.4发现白细胞增高至 170 109，血小板 511 109，血红蛋白 118g/dL。v 骨髓象显示早幼粒细胞占 6%，中幼粒细胞占 13%，核型分析未见分裂 象。v BCR-ABL 210基因阴性，经单融合 FISH探针证实骨髓 59%细胞 BCR-ABL融合基因阳性。v 接受格列卫治疗， 2006.9.7复查， FISH阳性细胞比例降低至 7.4%， 2006.10.23以后的复查结果 FISH都为阴性。一、诊断v 其他常用于诊断的探针还有： PML/RARA， AML1/ETO， CBF ， TEL/AML1等。v 以 CBF 探针为例 ： 发生 16号染色体倒位的细胞其荧光信号由 2F变成 1F/1R/1G。 有研究表明 CBF 探针对 inv(16)导致的CBF -MYH11融合基因的检出率与分子生物学的方法相当 。一、诊断一、诊断 急性淋巴细胞白血病v急性淋巴细胞白血病检测探针 探针定位 异常染色体GLP 4/GLP 10 GLP 4: 4p11.1-q11.1GLP 10: 10p11.1-q11.1 +4， +10GLP 17 GLP 17: 17q11 +17GLP TEL/GLP AML1GLP AML1： 21q22GLP TEL： 12p13 t(12;21)GLP MLL GLP MLL： 11q23 t(11;v)GLP BCR/GLP ABL(DF) GLP BCR: 22q11.2GLP ABL: 9q34 t(9;22)一、诊断 淋巴瘤v鉴别诊断，以 BCR/ABL探针为例： 额外信号的 BCR/ABL探针（ ES） 根据荧光信号的模式不同，可以鉴别 MBCR断裂点（ P210）和 mBCR断裂点 (P190)。 MBCR断裂点的细胞呈现 1Y/2R/1G的信号模式，而 mBCR断裂点的细胞则是 2Y/1R/1G的信号模式。一、鉴别诊断一、鉴别诊断v 双色双融合信号探针（ DF） 虽不能区分 MBCR和 mBCR，但能检测 der（ 9）的部分序列缺失 。 ABL和 BCR基因同时缺失： 1R/1G/1Y ABL基因单独缺失： 1R/2G/1Y 。 ES探针却无法检测 der（ 9）的部分序列缺失，其信号均显示 1R/1G/1Y 。一、鉴别诊断vIgH-CCND1 男性 ， 54岁患者，左颌下肿块 2月余 白细胞增高（ 21.3 109/L） 骨髓涂片见到增生活跃，以成熟淋巴细胞增生为主，考虑慢性淋巴细胞白血病。 流式分析显示 CD5+CD19+细胞占 86.5%，以 CD19+的细胞群设门， CD23+细胞约占 16.3%。 FISH检测患者外周血，约 50%的圆形细胞显示融合信号， 提示 套细胞淋巴瘤 可能性大 。 病理证实了左颌下淋巴结非霍奇金套细胞淋巴瘤。vCLL中的应用 CLL的细胞大多处于间期，有丝分裂活性较低，细胞往往不分裂，即使分裂的细胞绝大多也是正常核型，核型分析的异常检出率很低。 CLL的遗传学异常被认为与存活期有关： 正常核型和 13q-预后相近 +12、 11q-和 17p-的预后均较差二、治疗和预后分层 FISH共检出了 23例异常（ 76.7%）。 完成核型分析的 18例中仅 2例检出异常。 正常核型的 9例中， FISH检出 7例异常。 未见分裂象的 7例中， FISH检出 5例异常。 而且这些由 FISH检出的异常克隆比例基本都在 20%以上。CEP12 P53 D13S25 RB1 ATM 核 型阳性例数 11 2 13 12 1 异常 2 正常 9未见 7 未做 12二、治疗和预后分层vMM中的应用 MM的骨髓瘤细胞有丝分裂指数低，且由于骨髓浸润程度不同，常规核型分析异常检出率相对较低，检出的异常往往是超二倍体和 /或复杂核型。 MM的遗传学异常同样被认为与预后相关， 13q14的缺失被认为是复发和预后不良的独立危险因素，1q21扩增、 p53缺失也都提示预后不良。二、治疗和预后分层二、治疗和预后分层v FISH共检出了 17例异常（ 56.7%）。v 完成核型分析的 27例中 6例检出异常 （ 22.2%）。v 正常核型的 15例中， FISH检出 9例异常 。v 未见分裂象的 7例中， FISH检出 3例异常 。v FISH检出的异常克隆比例大多都低于 30%。v 浆细胞比例低于 20%，异常检出率会大大降低。1q21 P53 D13S319 RB1 IgH 核 型阳性例数 6 2 8 7 10 异常 6 正常 15未见 6 未做 3vMDS中的应用 FISH在 MDS中的应用价值相对较低。 MDS的患者大多能成功完成核型分析，且被分析的分裂象数目和质量尚可。 FISH检测普遍采用组合探针（ -5/5q-、-7/7q-、 +8、 20q-和 -Y）对五大类常见异常进行分析。二、治疗和预后分层v在我院新近完成的 70例 MDS患者的研究中 ： 核型和 FISH分别检出 21例和 22例异常，异常检出率相当。 核型异常但 FISH正常的 6例，这 6例异常均发生于探针覆盖范围以外区域。 核型正常而 FISH异常 7例，这 7