基础微生物学课件46

- -Try-his+ Try+his-Try+his+混合培养A B三、 转导 （ transduction）J.Lederberg等（ 1952）在 Salmonella typhimurium（ 鼠伤 寒沙 门 氏菌）中 发现 的。1.转导 及其 发现A B- -Try+his+Try-his+ Try+his-定义： 以温和 噬菌体为媒介，将供体细胞的 DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。2.转导 的种 类完全普遍 转导普遍 转导流 产 普遍 转导转导低 频转导局限 转导高 频转导（ 1） 普遍性 转导 （ generalized transduction）定 义 ： 通 过 完全缺陷噬菌体 对 供体菌任何 DNA小片段的 “误 包 ”而 实现 其 遗传 性状 传递 至受体菌的 转导现 象，称 为 普遍性转导 。1.1完全 (普遍性 )转导 ： complete transduction。 1952年发现 ，在 Salmonella typhimurium中存在 转导现 象。在它的完全普遍性 转导实验 中：以其野生型菌株作 为 供体菌营 养缺陷型菌株作 为 受体菌P22噬菌体作 为转导 媒介， 对 供体菌是烈性噬菌体， 对 受体菌是温和噬菌体过 程： 供体菌 正常噬菌体 + 完全缺陷噬菌体少量裂解物 + 大量受体菌 遗传稳 定的 转导子裂解完全普遍 转导（ 1） 普遍性 转导 （ generalized transduction）过 程：P22在供体菌内增殖 时 ，宿主的核染色体 组 断裂，待噬菌体成熟与包装之 际 ，极少数（ 10 6 10 8）噬菌体的衣壳将与噬菌体 头 部核心大小相似的一段供体 DNA片段 误 包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。供体菌裂解 时 ，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混， 使其 感染复数（ m.o.i） 1， 这 种完全缺陷噬菌体就会将 这 一外源 DNA片段 导 入受体 细 胞内。在 这 种情况下，由于一个受体 细 胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体 细 胞不会 发 生往常的溶原化，也不 显 示其免疫性，更不会裂解和 产 生正常的噬菌体；而由于 导 入的外源 DNA片段可与受体 细 胞核染色体组 上的同源区段配 对 ，在通 过 双交 换 而整合到受体菌染色体 组 中，所以使后者成 为 一个 遗传 性状 稳 定的 转导 子。感染复数（ m.o.i， multiplicity of infection） :感染复数 由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞所能吸附的噬菌体的数量 ,m.o.i一般很大，可达 250360。由于超 m.o.i的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌体的裂解，称为 自外裂解（ lysis from without） 。噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1）包入的完全是噬菌体的 DNA（ 正常噬菌体 ） 2）包入的完全是细菌 DNA（ 完全缺陷噬菌体 ） 3）部分带有噬菌体基因的 DNA（ 部分缺陷噬菌体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。噬菌体裂解第一个宿主一个 稳 定的 转导 子的形成1. 第一次交 换2. 第二次交 换3. 交 换 完成，外源 DNA掺 入染色体 组 中1.2流 产 普遍性 转导 （ abortive transduction）概念： 受体菌 经转导获 得的供体 DNA片段在受体菌中不 发 生配 对 、交 换 和整合，也不迅速消失，而只是 进 行 转录 和 转译 （性状表达）， 这 种 现 象就称 为 流 产转导 。现 象： 发 生流 产转导 的 细 胞在其 进 行 细 胞分裂后，只能将 这段外源 DNA分配 给 一个子 细 胞，而另一子 细 胞 仅获 得供体基因的 产 物 酶 ，在表型上表 现 出 轻 微的供体菌特征，每经过 一次分裂，就受到一次稀 释 ，所以，能在 选择 性培养基平板上形成微小菌落就是流 产转导 的特点。2. 局限性 转导定 义 ：通 过 部分缺陷的温和噬菌体 把供体菌的少数特定基因携 带 到受体菌中，并 获 得表达的 转导现象。特点 ：噬菌体 对 供体菌和受体菌都是温和噬菌体只能 转导 供体菌的个 别 特定基因（一般 为 噬菌体整合位点两 侧 的基因）该 特定基因由 部分缺陷的噬菌体 携 带缺陷噬菌体使由于其在形成 过 程中所 发 生的低 频 率（ 约10 5） “误 切 ”，或由于 双重溶源菌 的裂解而形成（ 约形成 50% 缺陷噬菌体）分 类 ：低 频转导 与高 频转导转导 的 过 程该 溶源菌被 诱导 裂解 时 ，有极少数（ 10 5）的前噬菌体（prophage） 发 生不正常切离（abnormal excesion）， 其 结 果会将插入位点两 侧 之一的少数宿主基因（如 E.coli 前噬菌体的两 侧 分 别为发 酵半乳糖的 gal基因或合成生物素的 bio基因 ） 连接到噬菌体 DNA上（而噬菌体也将相 应 的一段 DNA遗 留在宿主的染色体 组 上），通 过 衣壳的 “误 包 ”，就形成了一种特殊的噬菌体 缺陷噬菌体（defective phage）。 它 们 没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成 为 一个局限 转导 子， 对 噬菌体没有免疫性。温和噬菌体感染受体菌后，其 DNA会开 环 ，以 线 状形式整合到宿主染色体的特定位点上，从而使宿主 细 胞 发 生溶源化，并 获 得 对 相同温和噬菌体的免疫性。一般的 转导现 象中，从宿主染色体上切离 时发 生不正常切离的 频 率极低，故 这 种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（ 10 4 10 6）。把这 种裂解物称 为 LFT（ 低 频转导 ）裂解物 。用 LFT裂解物以 低 m. o. i（ 感染复数） 感染宿主，就可 获 得极少量的局限 转导 子，即低 频转导 。2.1低 频转导 （ LFT， low frequency transduction）E.coli K12 ( )gal+(供体菌 ) (大量 ) + dgal+（ 10-5）E.coliK12Sgal-(受体菌 ) E.coliK12Sgal-/ dgal+E.coliK12Sgal-/ dgal+/ E.coliK12Sgal-/ dgal+/ （ 双重容源菌供体） (50%) + dgal+（ 50% ）E.coliK12Sgal-(受体菌 ) E.coliK12Sgal-/ dgal+（ 转导子） （双重容源 转导子）高 频转导 和低 频转导图解低频转导高频转导U.V.U.V.双重容源菌【 E.coliK12( / dg)】 转导噬菌体（ dg） + 辅助噬菌体（ ）转导子菌落 噬菌斑U.V.附当用 LFT裂解物以高 m. o. i 感染 E. coli gal（ 不 发 酵半乳糖的 营养缺陷型）菌株 时 ，凡是感染有 dgal噬菌体任一 细 胞，几乎都同 时 感染有正常的 噬菌体。 这时 与 dgal同 时 整合在一个受体菌的核染色体 组 上，从而使它成 为 一个 双重溶源菌（double lysogen） 。 当双重溶源菌被紫外 线 等 诱导时 ，其中的正常正常 噬菌体的基因可噬菌体的基因可 补偿补偿 dgal缺失的部分基因功能缺失的部分基因功能 ，因而两种噬菌体就同 时获 得复制的机会。所以在双重溶源菌中的正常 噬菌体被称 为 助体（或 辅 助）噬菌体（ helper phage） 。双重溶源菌的裂解物中含有等量的 和 dgal粒子，称 为 HFT（ 高频转导 ）裂解物。用 HFT裂解物以低 m. o. I 感染另一个 E. coli gal（ 不 发 酵半乳糖的 营 养缺陷型）受体菌，就可以高 频 率地把它 转 化 为 能 发 酵半乳糖的 E. coli gal+ 转导 子。是 为 高 频转导2.2高 频转导 （ HFT， high frequency transduction）比 较项 目 普遍性 转导 局限性 转导转导 的基因供体染色体或染色体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体 紧 密 连锁 的少数几个个 别 基因噬菌体寄生的位置不 结 合在寄主染色体特定位置上结 合在寄主染色体特定位置上获 得 转导噬菌体的方法通 过 敏感菌的裂解或容源菌的 诱导 紫外 线诱导 容源菌转导 子的区 别一般 稳 定，非溶原性（不表 现 出任何噬菌体的性状，包括免疫性）一般不 稳 定，呈缺陷溶原性（ 对 同源噬菌体具有免疫性，但不表 现 出其它噬菌体的性状）普遍性转导和局限性转导的比较3.溶源 转变概念：当温和噬菌体感染宿主而使其 发 生溶源化 时 ，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因 组 上，而使后者 获 得了除免疫性以外的新性状的 现 象，称 为 溶源 转变 。性 质 ：表面上与 转导 相似，而本 质 上不同于 转导 。区 别 ：当宿主 丧 失其原噬菌体 时 ，通 过 溶源 转变 而 获 得的新性状也随之消失温和噬菌体不携 带 来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主 获 得新性状温和噬菌体使完整的，不是缺陷的获 得新性状的是溶源化的宿主 细 胞，不是 转导 子典型 实 例：Corynebacterium diphtheriae（ 白喉棒杆菌）：白喉毒素 / 温和噬菌体Clostridium botulinum（ 肉毒梭菌）： C型或 D型肉毒毒素Salmonella anatum（ 鸭 沙 门 氏菌）： 细 胞表面多糖 /E15噬菌体Streptomyces erythreus（ 红 霉素 链 霉菌）：合霉素合成和气生菌 丝 形成 /P4温和噬菌体（四）原生质体融合 protoplast fusion概念： 通 过 人 为 方法，使 遗传 性状不同的两 细 胞的原生 质体 发 生融合，并 进 而 发 生 遗传 重 组 以 产 生同 时带 有双 亲性状的 遗传 性 稳 定的融合子（ fusant） 的 过 程，称 为 原生质 体融合。适用范 围 ： 各种生物 细 胞都能 进 行原生 质 体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等 动 植物和人体的不同 细胞。意 义 ： 70年代后 发 展的一种育种新技 术 ， 继转 化、 转导 和接合之后一种更有效的 转 移 遗传 物 质 的手段。原生 质 体融合不 仅 能在不同菌株或种 间进 行， 还 能做到属 间 、科间 甚至更 远缘 的微生物或高等生物 细 胞 间 的融合。发 展点： 有关原生 质 体融合的 遗传 机制，尚未研究清楚，目前 还 在探索中。l原生质体融合的优点：可以提高重组率双亲可以少带标记或不带标记可进行多亲本融合有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量 原生 质 体融合的主要步 骤 ：选择亲 株 制 备 原生 质 体 原生 质 体融合 原生 质 体 再生 筛选优 良性状的融合重 组 子二、真核微生物的基因重 组主要方式：有性 杂 交准性 杂 交原生 质 体融合（略）转 化（略）（一）有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。酵母菌的有性 杂 交育种（一）酵母菌的 生活史 （复 习 ）（二）酵母菌有性 杂 交技 术酵母菌有性 杂 交程序一般 为 ： 亲 本的 单 倍化有性 杂 交杂 交后代的 检 出筛选优 良性状个体1. 亲本的单倍化1) 杂交亲本单倍体细胞的分离A. 子囊孢子的形成a. 形成子囊的条件b. 一般方法B. 单倍体子囊孢子的分离a. 显微操作器分离单倍体子囊孢子法b. 酶法c. 机械研磨法C. 单倍体菌株的确定a. 单倍体细胞与二倍体细胞在 形态方面的区别b. 生孢子能力的测定c. 单倍体细胞结合型的确定2) 杂交亲本单倍体细胞遗传标记的制作酵母菌有性 杂 交的方法：1. 可口可乐2. 酵母菌有性杂交1. 孢子杂交法2. 群体交配法3. 单倍体细胞杂交法3. 杂交后代的检出4. 筛选优良性状个体S. Cerevisiae 的双倍体和 单 倍体 细 胞的比 较项 目 双倍体 单 倍体细 胞 大， 椭圆 形 小，球形菌 落 大，形 态 均一 小，形 态变 化 较 多液体培养 繁殖快， 细 胞 较 分散 繁殖 较 慢， 细 胞常聚集成 团在 产孢 子培养基上