海洋放线菌#a34和真菌#1942活性成分研究彭虹王立,林永成

海洋放线菌#A34 和真菌#1942 活性成分研究彭虹 1 王立，林永成 2*中山大学化学与化学工程学院， 广州 510275摘要 海洋环 境十分独特，极端的生态环境必然赋予生存于其中的海洋微生物不同于陆生微生物的独特的遗传背景和生理性能，并使其 发展出独特的代谢方式，因而 为寻找海洋新型生物活性物质提供了潜在的丰富的源泉。本文阐述了海洋放线菌和海洋真菌代谢产物研究的意义和研究进展。实验部分对放线菌#A34 和真菌#1942 的代谢产物进行分离鉴定，得到 7 个化合物，其中包括从南海真菌#1942 发现，价格昂 贵，有 细胞毒性的 sterigmatocystin，其含量高达约1g/100L ,有可能开发成为资源菌。关键词 代谢产物 海洋放线菌 海洋真菌一 引言海洋，占地表总面积 71%，是独特生态系统工程的微生物的生存繁衍地。由于海洋环境的特殊性和微生物独特的遗传背景，海洋微生物已发展出不同于陆地微生物的独特代谢方式，因而为寻找海洋新型生物活性物质提供了潜在的丰富的源泉。研究海洋微生物代谢产物不仅能够从中寻找新的抗生素和抗病毒等活性物质，在维护人类健康方面有着重要意义；而且用工业发酵生产可减少污染、节约能源、降低成本、提高产量，从而实现可持续发展。二 海洋放线菌和真菌的研究情况2.1 海洋放线菌的研究情况放线菌（Actinomycetes ）是一大类具有分枝状菌丝体的革兰氏阳性菌，最早由Cohn（1875 ）由人泪腺感染病灶中分离到一株丝状病原菌 链丝菌（streptothrix ）而发现的。由于 Waksman（1943）和其他研究者的创造性工作，陆续放线菌的一些种中分离到氯霉素、四环素、新霉素和红霉素等。从此，放线菌作为抗生素和其他生物活性次生代谢产物的重要微生物资源而越来越受到人们的关注。目前世界药物市场上的 67%的抗生素产品来自微生物，其中2/3 又是放线菌所产生（Newman and Laird,1997） 。海洋放线菌代谢产物类型丰富，有内酯类、吡喃酮类、醌类、生物碱类、肽类、酰胺类等化合物。如 Masashi Tsuda 等 1从放线菌 brasiliensis IFM 0955 中分离到一个新的大环内酯类抗生素，命名为 Brasilibactin A，对微球菌和葡萄球菌有抑制活性(MIC 0.73 and 4.5 mg/mL, respectively)，而且对人体表皮癌细胞有很强的体外细胞毒作用(IC 50, 0.04 g/mL)；Scott S. Mitchell 等 2从海洋沉积物样品分离到的链霉菌 aureoverticillatus NPS 001583 中发现了结构新颖1 基金项目 中山大学化学与化工学院第五届创新化学实验基金项目（批准号：31）资助；第一作者 彭虹（1983 年出生） 中山大学化学与化工学院化学系 01 级化学专业。2 指导老师 林永成 E-mail: 王立 博士,中山大学化学与化工学院 02 级有机化学专业。海洋放线菌#A34 和真菌#1942 活性成分的研究201的 22 元环内酰胺，命名为 Aureover -ticillactam，对直肠癌细胞、黑素瘤、急性白血病 T 细胞等均有适中的 EC50 值。放线菌除了是寻找和发现天然生物活性物质的重要生物资源外，也是环境污染生物治理中值得重视的重要生物类群。它们可用于降解橡胶制品，处理活性污泥，以及工业发酵生产。2.2 海洋真菌的研究情况海洋真菌的分布极为广泛，可从来源于海洋的不同的基质中找到,如红树林的树干、树叶、气根、海藻、海洋漂浮的木头、海水浸泡的沼泽地、死亡的珊瑚、海洋沙滩种植物、海底沉积物，海洋中各种动物的体内，体表的共生真菌等 3。海洋真菌代谢产物类型包括杂环类、环肽类、生物碱类、肽类、酮类、萜类等化合物。如日本 Sankyo 研究小组 4从海洋担子菌 deuteromycete Phoma sp.分离的到 phomactin A 可以作为新型的血小板活化因子拮抗剂。三 海洋放线菌#A34 和真菌#1942 活性成分的研究3.1 实验试剂与仪器葡萄糖 CP，蛋白胨 BR，酵母膏 BR，粗海盐（微生物养殖用） ，其它实验用试剂均为市售AR 试剂。薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的硅胶 G、 GF254、H 、HF 254，柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的 200-300 目硅胶及硅胶 H。核磁共振仪(Varian，INOVA-500)；红外光谱仪（Bruke，EQUINOX55-A590/3F）；显微熔点仪（北京物理光学仪器厂，X4型）；质谱仪（VG，ZAB-HS ）；元素分析仪器（Elementar，Vario EL CHNS-O）。3.2 菌种和培养基放线菌#A34 是 Streptomyces sp.链霉菌属，由中山大学生命科学院从海南陵水猴岛海底沉积物中分离得到，孢子成密螺旋状，菌落正面海军蓝色，反面海涛蓝色，无色素。产抗细菌活性物质。放线菌#A34 由广东省农科院植保所发酵罐培养 350L。培养基为：KNO 3 1g； K2HPO4 0.5g； MgSO4 0.5g； FeSO4 0.01g；可溶性淀粉 20g；海盐 40g；蒸馏水 1L； pH 6.5。真菌#1942 由香港城市大学 Vrijmoed 和 Jones 教授于香港附近海域分离得到, 菌种分别保存在香港城市大学和中山大学内。真菌#1942 由天然有机室摇床培养 150L。采用 GYT 培养基：Glucose(葡萄糖) 1.0；Yeast-Extract(酵母膏) 0.1；Tryptone( 蛋白胨) 0.2；pH 7.5； ASW（人工海水）100ml。3.3 培养与形态放线菌#A34 由发酵罐培养，通氧气发酵培养 3 天，得到白色菌体和浅色的发酵液。真菌#1942 菌种接入 GYT 琼脂斜面后，置于 22恒温培养箱里培养 7 天，再接入装有100mlGYT 培养基的 500ml 的三角瓶里室温培养 15 天。然后将已长好的 #1942 菌种转接入内装300mlGYT 培养基的 500ml 三角瓶中，共约 150L。5 天后培养液里出现少量的菌丝体，10 天后液面出现白色的菌体，溶液颜色变深，30 天后液面长满菌体，菌体颜色由白变红，培养液颜色变红变暗。45 天后溶液颜色不再变化为深暗红色，菌体为红黑色。3.4 提取与分离#A34的菌体和培养液用纱布分离。菌体风干后甲醇充分提取（250L3） ，提取液合并浓缩得粗提物20g。培养液于60减压浓缩三次，用乙酸乙酯充分萃取得发酵液粗提物约10g；硅胶202拌样过柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得化合物A34-1、2、 3。#1942 的发酵总物用纱布过滤得菌体。菌体风干后用甲醇浸泡提取，蒸干得到浸膏约 30g,再用乙酸乙酯提取得到菌体提取物。培养基用乙酸乙酯萃取得到培养基提取物。菌体、培养液的提取物分别拌硅胶过柱，以乙酸乙酯和石油醚混合溶液梯度淋洗。收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶纯化，得化合物 1942-1、2、3、 4。其中 20-30%洗脱出 1942-1，50%-60%洗脱出 1942-2。1942-1 三次重结晶后为淡黄色长针状晶体，约 800mg。四 结果与讨论4.1放线菌#A34放线菌#A34 自海南陵水猴岛海底沉积物中分离得到，由发酵罐培养 350L。培养液提取物通过反复柱层析得到以下三个化合物：A34-1、2、3。经核磁共振、红外波谱等分析手段以及与文献 5-6对照可确定结构如图，实验数据见附录。H3C CH2 CH2 CH2 CHCH3CHCOHCH3A34-1: 2-正 丁 基 -3-甲 基 -丁 二 酸HOCHOCA34-2: piliformic 酸NH OOA34-3: 尿 嘧 啶图 A34-123结 构 式4.2真菌#1942真菌#1942 自香港附近海域分离得到，由天然有机室摇床培养 150L。菌体提取物通过反复柱层析得到以下三个化合物：1942-1、2、3、4。其中 1942-1 经柱层析（20-30%乙酸乙酯和石油醚混合溶液反复洗脱） 、重结晶等操作分离提纯，根据核磁、质谱等分析方法确定结构为柄杆菌素（Sterigmatocystin） 。柄杆菌素是黄曲霉素的生源合成前体， 具有很高的研究价值。 1.1942-1:7H-Furo3,2:4,5furo2,3-cxanthen-7-one,3a,12cdihydro8-hydroxy-6-methoxy-(9CI) (柄杆菌素,Sterigmatocystin)C18H12O6, 淡黄色长针状晶体，m.p. 249251，薄层层析石油醚乙酸乙酯31，R f=0.45。 1H NMR(500MHz,CDCl3,TMS) 13.09(1H,s),7.48 (1H,t,8.1,8.4Hz),6.82 (1H,d,8.1Hz),6.81(1H,d,7.1 Hz),6.74(1H,d,8.4Hz),6.50 (1H,m),6.42(1H,s), 5.44(1H,t, 2.7Hz), 4.80(1H,m), 3.99(3H,s)； 13C NMR (CDCl3): 181.2, 164.6,163.4,162.4, 155.0, 154.1,145.4, 135.8,113.5, 111.4, 109.1,106.7,106.1,102.7, 90.7,57.1,48.4; FABMS 中分子离子峰 m/e 325 M + 1+;元素分析(w/%,): C 66.23, H 4.174. 计算值(C 18H12O6): C 66.67, H 3.70。通过分析 13C NMR 可知分子中含有 18 个碳原子，其中 1 个 OCH3、8 个 CH、9 个季碳。 H 6.82 为缩醛基，羟基 H 13.09 处于低场，说明可能存在氢键 C=OHO。进一步与文献 7波谱数据及 13C NMR 谱图对比得到确证，结构如图 ，谱图见附录。O OOHH HO OMeHHHOHH H图 1942-1 柄 杆 菌 素 (Sterigmatocystin)海洋放线菌#A34 和真菌#1942 活性成分的研究203sterigmatocystin最初从真菌Sterigmatocystis 8中发现，后来又从曲霉菌Aspergil -lus nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus ustus and Aspergillus versicolor9-11中发现该化合物，并通过药理实验确定其有细胞毒性和致癌活性，引起了人们广泛关注。sterigmatocystin 是细胞毒性更强的化合物黄曲霉素（aflatoxin B1）的生源合成前体，它本身的活性很弱，（Bel-7402 and NCIH-460 in vitro with IC50 96.5310-6 and 72.5210-6 g/mL resp 7）但被体内的氧化酶活化之后，形成非常活泼的致癌前体 环氧化物，易受到遗传物质中鸟嘌呤极具亲核作用的 7 位 N 的进攻而形成 sterigmatocystin formamido pyrimidine（FAPY）加合物，并进行复制和繁殖 12 ，机理见图。O OHHH OOCH3HOOHHHO HHN HNHNOH2NNHRdCHOduplex A1-A2-T3-F4-C5-A6-T7-T8T8-T7-A6-C5-F4-T3-A2-A1STST图 sterigmatocystin 致 癌 机 理由于食品饲料中普遍存在产生 sterigmatocystin 的真菌，所以研究这类化合物的快速高效的检测方法和其致癌机理逐渐成为热点。如 2004 年 Stroka, Joerg 等人报道的采用高效氨基酸薄板层析方法，最低检出浓度为 2 g/kg 。另一方面，sterigmatocystin 价格非常昂贵，1996 年Sigma -Aldrich 公司报价为 20.75 美元/毫克，此后价格一路攀升，2002 年为 29.80 美元/ 毫克，2003 年为 37.10 美元/毫克，2005 年最新报价为 40.90 美元/毫克。这给研究工作带来极大不便。而通过发酵培养海洋真菌#1942 150L 得到约 800mg 的 sterigmatocystin，为 sterigmatocystin 及其同类化合物的研究工作提供了廉价的来源。2.其他化合物1942-2、3、4 经核磁共振等分析手段以及与文献 13-14对照可确定结构如图，实验数据见附录。OOHOHOOHOCH3 OOH O HO1942-4 麦 角 甾 醇1942-3 5-methylmelein1942-2 类 Bostrycin化 合 物 图 1942-2、 3、 4结 构 式4.3结论及展望对放线菌#A34 和真菌#1942 的代谢产物进行分离鉴定，得到 7 个化合物，其中包括价格昂贵，有细胞毒性的 sterigmatocystin。其含量高达约 1g/100L ,有可能开发成为资源菌。海洋微生物能产生丰富的结构独特的生物活性物质，利用现代微生物发酵技术，把海洋微生物作为药物的生产者，有可持续发展，成本低廉，质量保证等优点。随着研究的不断深入，微生物将会创造出更大的经济和社会效益。致谢：导师林永成教授从理论上和实践上对本文的工作做了深入细致的指导，在此向导师致以诚挚的谢意和崇高的敬意；感谢天然有机实验室的王立博士对本论文的指导与帮助。204同时对天然室的全体老师和师兄师姐的支持和帮助表示感谢。本实验得到中山大学化学与化工学院第五届创新化学实验与研究基金的资助和中山大学测试中心提供的帮助，特此鸣谢！参 考 文 献1Masashi Tsuda, Masaaki Yamakawa, Seiko Oka et al. Brasilibactin A, a Cytotoxic Compound from Actinomycete Nocardia brasiliensis. J. Nat. Prod. 2005, 68, 462-4642Scott S. Mitchell, Benjamin Nicholson, Sy Teisan, et al. Aureoverticillactam, a Novel 22-Atom Macrocyclic Lactam from the Marine Actinomycete Streptomyces aureoverticillatus. J. Nat. Prod. 2004, 67, 1400-14023Kevin D. Hyde, V. Venkateswara Sarma, E.B. Gareth Jones. Marine Mycology-A Practical Approach 2000. Leds. K.D.Hyde and S.B. Pointing Soc., Perkin Trans. 1, 1999,715-719.4M Sugano, A Sato, Y Iijima, et al. Phomactin A: A Novel PAF Antagonist from a Marine Fungus Phoma sp. J Am Chem Soc,1991,113:54635464.5Anderson, John R, Edwards et al.Metabolites of the higher fungi. Part 2. 2-Butyl-3-methylsuccinic acid and 2-hexylidene-3- methyl succinic acid from xylariaceous fungi. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1:Organic and Bio-Organic Chemistry ,1985 1481-1485. 6Wong J L, Fushs D S. Competitive Isomerization and Dealkylation of 2,4-Dialkoxypyrimidines in Aqueous and Nonaqueous Media. J. Org. Chem. 1970,35:3786.7Cox R H, Cole R J. Carbon-13 nuclear magnetic studies of fungal metabolites, aflatoxins, and sterigmatocystins. J. Org. Chem. 1977, 42(1): 112-114. 8Nekam Lewis, Polgar P. The inihibitory effect of a mold upon staphylococcus. Urologic and Cutaneous Review. 1948, 52:372-5. 9Davies J. E., Roberts John C., Wallwork S. C. Sterigmatocystin, a metabolic product of Aspergillus versicolor. Chemistry 1H NMR（300MHz ,CDCl 3 ,TMS）:2.67（2H,m）,1.68（1H,ddt, 4.5,9.0, 9.0Hz）,1.52（1H,ddt,5.5,9.0,9.0Hz）,1.32（4H,m）,1.17（3H,d, 7.0 Hz）,0.90（3H,t,6.5Hz）; 13C NMR (500MHz , CDCl3, TMS):180.4, 179.6,47.4,41.1, 29.6,29.5, 22.4,13.8, 13.7.2.A34-2: C11H17O4,白色粉末, mp: 148-150 , 1H NMR :(500MHz, CDCl3, TMS):12.11 (2H, brs),7.02 (1H,t, 7.5Hz),3.57(1H,q,7.5Hz), 2.27-2.21(2H,m,7.5Hz), 1.50(2H,m,7.0Hz),1.32-1.31(4H,m), 1.35 (3H, d,7.5Hz),0.90(3H,t,7.5Hz);IR / -1 (KBr): 3840, 3754,2930, 1796,1716,1677, 1462,1301, 1252.3. A34-3: C4H4N2O2,黄色针晶, mp260(升华); molecular weight:112; 1H NMR (500MHz,DMSO): 5.42(1H,d,7.5Hz), 7.35(1H,d,7.5 Hz),10.72(1H,s),10.91 (1H ,s).海洋放线菌#A34 和真菌#1942 活性成分的研究2054.1942-2: C16H16O6,褐色结晶,molecular weight : 304.29, mp 213-215, 1H NMR(500MHz, CDCl3, TMS): 12.60(1H,s),7.62(2H,brs), 7.36(1H,s),6.11(1H,s),3.90(3H,s),3.82(1H,t, 5.5, 5.5Hz), 3.08(1H,d, 17Hz,H),2.99(1H,dd,18.5,5Hz),2.92(1H,dd,18.5,5.5Hz),2.79(1H,d,17 Hz,H),1.26(3H,s).5.1942-3: C11H12O3,针状晶体,mp 131-133;FABMS m/z: 193M+1 +;1H NMR(500MHz,CDCl3): 11.07(1H, s), 7.38(1H,d,8.5Hz), 6.78 (1H,d,9.0Hz),4.75(1H,m),3.13(1H,dd,3.5, 17Hz), 2.72(1H,dd, 12, 17Hz), 2.21(3H,s), 1.51(3H,d,6.5Hz).6.1942-4: C28H44O,白色针状结晶, mp 155-157; 1H NMR(CDCl3,TMS): 0.63(3H,s),0.83 (3H,d, 6.0 Hz),0.84(3H,d,6.0Hz),0.92(3H,s), 1.03(3H,d,6.5Hz),3.64(1H,m),5.19(1H,dd,15.5,8.0Hz),5.22(1H,dd, 15.0,7.0Hz),5.38(1H,d,6.0Hz),5.57(1H,d,4.0Hz).图1942-1 Sterigmatocystin 1H NMR（500MHz,CDCl 3,TMS）The meta