血站核酸扩增检测实验室工作规范1

血站核酸扩增检测实验室工作规范为使核酸扩增检测技术有效地应用于血液筛查，保证血液安全，特制定本规范。一、血站核酸扩增检测实验室的规范化设置及其管理血站核酸扩增检测实验室的规范化设置详见临床基因扩增检验实验室管理办法（卫医发2010(待定)号文）附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。为避免污染，必须严格遵循临床基因扩增检验实验室设置标准设置血站核酸扩增检测实验室。血站核酸扩增检测实验室应根据仪器设备特点设置工作区域，各区域仪器设备应固定不可移至其它区域。各区域都必须有明确的标记，以避免设备实验器材如加样器、试管或加样器吸头架、试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备和实验器材发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本处理（混样）、核酸纯化、扩增检测区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增检测区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。（一）试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性可通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于“热启动”技术（在第一个高温变性步骤后加入酶），聚合酶也可不包含在主反应混合液中。在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并根据需要及时更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体，离心管和吸头等消耗品应适用于核酸检测，无 DNase、RNase 等扩增检测抑制物，或采取高压等处理措施处理。工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm 波长），在工作完成后调至实验台上 6090cm 内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基对（bp），对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。（二）标本处理区下述操作在该区进行：标本用于混合或核酸纯化前的保存，标本的混合，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。要正确使用标本处理设备，包括样本混合、核酸纯化设备。由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件，避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液）容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等）如出现外溅，则必须分别处理并做出记录。对实验台适当的紫外照射（254nm 波长，与工作台面近距离）适合于灭活去污染。可采用可移动紫外线灯照射工作后的实验台面样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。（三）扩增（检测）区下述工作在本区内进行：cDNA 合成、DNA 扩增及检测。不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。必须注意的是，所有经过检测的反应管不得在此区域打开。完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理并做出记录。（四） 扩增产物分析区下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。但目前用于血液核酸检测的试剂该区域通常与扩增区合并使用。核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标记）、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern 转移、核酸测序方法等。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用 PCR-ELISA 方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至 1 mol/L HCl 中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离 PCR 实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至 1 mol/L HCl 中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故应注意实验人员的安全防护。本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下（如安装排风扇）可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。二、血站核酸扩增检测实验室质量保证血站核酸扩增检测实验室质量保证涉及到整个扩增检验的所有阶段，即测定分析前的标本采集及其运送和保存、测定中的核酸提取、扩增检测以及测定后的结果报告等。（一）标本的采集。用于血液核酸扩增检测的标本包括血清和血浆（EDTA 或枸橼酸钠抗凝）等。采集血液等样本时，应使用一次性无菌含分离胶真空采血管。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的 RNA 酶。最好是热灭菌，250烘烤 4 小时以上可使 RNA 酶永久性失活。如使用血浆标本，全血标本必须进行抗凝处理。EDTA 和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是 Taq 酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于 RNA（如 HCV RNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（3 小时以内）分离血浆，以避免 RNA 的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在 1 小时内分离血清。（二）标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于 RNA 检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。（三）标本的贮存。血清/血浆标本的短时间保存可根据所用试剂盒说明书确定，但必须采用适当的实验进行验证。长时间贮存应在70下。用于 DNA 测定的已纯化核酸样本可在 10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA 缓冲液（pH 7.5-8.0）中 4C 保存。用于 RNA 测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80C 或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20C 即可。（四）标本的处理(核酸提取)。标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等），这些物质可能对对其后扩增检测有抑制作用，从而影响病毒核酸的有效检出。此外，当靶核酸为 RNA 时，逆转录 PCR 测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的 RNA 酶的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有 RNA 降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。（五）靶核酸的逆转录（RT）和扩增1.靶 RNA 的逆转录 cDNA 合成为逆转录 PCR 中的第一个酶反应步骤，所产生的 cDNA 为靶 RNA 的反向互补链，为后面扩增的模板。下述因素通常影响 cDNA 合成的效率：（1）逆转录效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等；（2）用于逆转录的标本中存在逆转录或 Taq 酶的抑制物（如酚、氯仿、血红素等）；（3）RNA 酶的存在导致 RNA 的降解。2.核酸的扩增 有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq 酶失活、退火温度不对、Mg+浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要，必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查，以避免因孔间温度的差异导致检测的失效。（六） 污染 在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染（产物污染）；试剂污染（贮存液或工作液）以及标本间交叉污染（如阳性标本气溶胶扩散到原本阴性的标本）。血站核酸检测实验室中污染的最主要来源是扩增产物的污染。一旦发生污染后，围绕实验室寻找污染源耗时且很繁琐，所以防止污染重在预防。但如果发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源并清除污染为止，并且实验结果必须作废。1. 测定分析前的污染源测定分析前实验材料的污染主要来自非标本来源的核酸。2. 测定分析阶段的污染源测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的实验设备的任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂（例如牛血清白蛋白，明胶或矿物油）、商品酶制剂、消耗品（如反应管，吸头）和实验设备（如混样仪、核酸提取仪、加样器、离心机）等。在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使用的试剂、消耗品或实验设备的污染。而在产物分析区，当吸取扩增产物用于检测时，非常容易引起污染，因此必须制定标准操作程序（SOP），并严格执行。3. 污染的避免要避免污染，首先是预防而不是排除污染，前面所述对工作区的严格划分的目的即是为了预防污染。为避免以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩增反应中用 dUTP 取代部分dTTP，使得产生的特异扩增片段含有尿嘧啶，这样扩增前在反应混合液中加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避免其对以后要进行的扩增测定的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射，通过异补骨脂素光化学产生 DNA 加合物，由于 DNA 加合物对扩增没有反应但又不妨碍 PCR 后杂交过程，所以这种方法也能防止污染。上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其来替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩增的天然 DNA 的污染。4. 去除污染的措施工作完后必须定期对实验室采取有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最佳效果。去污染措施包括但不仅限下面几种：（1）用 10%（v/v）次氯酸钠清洁表面；（2）试验后长时间的紫外照射实验操作台面和其他表面；（3）实验设备如加样器的高压消毒。（七）扩增产物的分析扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适等。最常使用的基因探针有：DNA 片段、合成的寡核苷酸和体外转录的反义 RNA 探针。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光素和同位素等。在扩增后的杂交检测中, 应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性，还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高温度和/或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密控制温度和试剂的离子强度是避免假阳性和假阴性结果的前提。要注意的是，温度和离子强度不能同时改变。（八）质量控制质量控制包括两个方面，即室内质量控制（以下简称质控）和室间质量评价。1.室内质量控制必须对 DNA 和 RNA 分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和假阴性，保证测定结果的准确性和重复性。由于血站核酸扩增检测的高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中的每一步都要求有质控措施。每 40 个扩增检测至少要做一个阴性和一个弱阳性原血清（浆）质控样本。（1）标本制备： 对于血清（浆）中病毒的测定，要评价献血员标本出现溶血、脂血情况下核酸纯化方法对扩增检测的影响，避免由于标本处理方法的不当而出现假阴性结果。此外，还应采用已知浓度标本评价核酸提取方法的效果。在测定血清/血浆病原体核酸时，应使用已知的弱阳性和阴性血清/血浆作为质控样本，与待测献血员标本等同处理提取核酸及扩增，以监测核酸提取的有效性。（2）逆转录和扩增：本部份包括阳性质控和阴性质控。目前的商品核酸扩增检测试剂盒均采用内标进行假阴性质控。外加弱阳性质控不但可监测扩增反应液的质量，还可获得有关核酸扩增检测试剂的检测下限和特异性的信息。这些质控样本在扩增检测时必须使用与患者的标本相同的主反应混合液。每一个核酸检测实验中都必须设有外加阴性质控（污染监测质控），为判断扩增过程中污染出现的阶段，阴性质控可包括如下几种，即在样品制备的整个过程中所带的空白管、仅有扩增反应液但不含扩增模板的反应管、阴性标本等。阴性标本可以评估扩增检测的综合质量。在扩增靶 RNA 的 RT-PCR 实验中，可做省略逆转录的污染质控，通过这种方法，可发现以前扩增的 DNA 片段所引起的污染。（3）