用荧光显微镜结构及观察口腔上皮细胞的dna

实验 荧光显微镜结构及口腔粘膜上皮细胞 DNA的观察w实验目的w实验原理w仪器、材料与试剂w实验步骤w实验报告及思考题实 验 目 的了解荧光显微镜的基本构造和基本光路了解荧光探针 Hoechst33258或 33342与细胞成分的结合特性和光谱特性荧光显微镜什么是荧光 ?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。一种光化荧光 荧光的种类自发荧光 次生荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光荧光的性质w 吸收光w 保持固有的荧光特性w 荧光波长激发波长（ STOKES 法则）w 荧光强度极小于激发光的强度w 有不同程度的衰减w 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜汞灯汞灯紫外线保护罩紫外线保护罩孔径光栏孔径光栏 （ FS）视场光栏视场光栏 （ AS）落射荧光显微镜各部件特性和作用 汞灯光源汞灯光源 :提供激发光提供激发光 (UV、 B、 G) 激发滤色镜激发滤色镜 :波长选择波长选择nmT%BAND PASS落射荧光显微镜原理汞汞 灯灯激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜吸收滤色镜吸收滤色镜物物 镜镜 标标 本本滤色镜的选择荧光素的特性荧光素的特性 滤色镜的特性滤色镜的特性激发激发分色分色 吸收吸收 根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜实 验 原 理 荧光显微镜技术是利用一定波长的光（通常是波长荧光显微镜技术是利用一定波长的光（通常是波长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样品，样品获得能量，短的紫外光和蓝紫光）照射被检样品，样品获得能量，产生能量跃迁，从基态到汽激发态，再从激发态回到原产生能量跃迁，从基态到汽激发态，再从激发态回到原态，放出光和热能，产生的光为波长较长的光（相对于态，放出光和热能，产生的光为波长较长的光（相对于激发光波长），此可见光称为荧光。通过物镜、目镜的激发光波长），此可见光称为荧光。通过物镜、目镜的成像、放大，以供观察、检测和拍摄。成像、放大，以供观察、检测和拍摄。w 荧光显微镜要求有特殊的光源提供足够强度和荧光显微镜要求有特殊的光源提供足够强度和较短波长的激发光，诱发荧光物质发出较长波长较短波长的激发光，诱发荧光物质发出较长波长的荧光。视野中所看到的像，主要是样品的荧光的荧光。视野中所看到的像，主要是样品的荧光映像。荧光显微镜技术是在光学显微镜水平上对映像。荧光显微镜技术是在光学显微镜水平上对蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法之蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法之一。非免疫荧光探针可用来直接标记许多特殊的一。非免疫荧光探针可用来直接标记许多特殊的亚细胞组分及生物大分子。这些探针大多数能被亚细胞组分及生物大分子。这些探针大多数能被活细胞直接摄取并掺入和聚集在特定的细胞器中活细胞直接摄取并掺入和聚集在特定的细胞器中，因此我们就可以通过荧光显微镜对这些细胞器，因此我们就可以通过荧光显微镜对这些细胞器进行观察。进行观察。w Hoechst33258是一种亲脂性物质，可是一种亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，与跨膜进入活细胞，与 DNA特异性结合，它特异性结合，它主要结合在富含主要结合在富含 AT区域的区域的 DNA小沟部分。小沟部分。结合结合 DNA后荧光大大增强，最大激发光波后荧光大大增强，最大激发光波长约为长约为 350nm, 最大发射光波长约为最大发射光波长约为 461nm。可用于活细胞观察，不需要对细胞作固定。可用于活细胞观察，不需要对细胞作固定及透化处理。及透化处理。仪器、材料与试剂仪器：荧光显微镜，仪器：荧光显微镜，材料：口腔粘膜上皮细胞，载玻片，牙签材料：口腔粘膜上皮细胞，载玻片，牙签试剂：试剂： PBS(pH 7.4)Ho.33258 or H.33342（ 10g/mL， 溶于溶于PBS)实 验 步 骤w 在 1张载玻片上分别滴加一滴 PBS溶液w 用牙签刮取口腔上皮细胞，分别涂于载玻片上（牙签在液滴中搅匀）w 在涂细胞处分别滴加 10g/mL的 Hoechst.33342盖片 室温暗处孵育 2-3分钟w 用紫外光激发，观看细胞 DNA荧光注 意 事 项w 盖片时防止产生气泡盖片时防止产生气泡w 滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观滴