第七章蛋白质分分离纯化和表征2010

第七章 蛋白质的分离纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的 分子大小与分子量的测定三、胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质的变性与复性五 、 蛋白质分离纯化的一般原则六、蛋白质的分离纯化方法 七、蛋白质的含量测定与纯度一、蛋白质的酸碱性质蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有 两性解离性质 的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的 pH有关， pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少； pH升高，则解离情况相反。 等电点（ pI） : 在特定 pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一 pH 称为该蛋白质的等电点（ pI）。几种蛋白质等电点等电 pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。等离子点 (isoionic piont): 蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由 H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。二、蛋白质的分子大小与分子量的测定蛋白质的分子量的范围： 610 3 110 6 Da。（一）根据化学组成测定最低相对分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为 0.335%, 计算二者的相对分子质量。最低相对分子量 x 100 =铁的百分含量 铁的原子量0.335 55.8 x 100 =16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法也 可以利用蛋白质中含量特少的 aa， 用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。（二）渗透压法测定相对分子量渗透压法测定 Mr操作简单， Mr在 10-100 kDa时较准，但不能区别蛋白质分子是否均一 。渗透压公式： Mr = RTlimc0c(c=质量浓度， g/mol)渗透压法测定 Mr法的缺点： 不能确定溶液蛋白质分子是否均一。（三）沉降分析测定 Mr在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降。沉降速度决定于蛋白质的分子量、分子密度、分子形状和溶剂的密度、粘度。 沉降系数（ 20,w）： 单位离心场强度时的沉降速度。定义 1 10-13秒（斯维得贝格单位）。Mr = RTSD(1 V) 沉降速度法其中 :S:是沉降系数D:是扩散系数:是溶剂的密度v:是蛋白质的偏微分比容。将纯的分析样品放于离心池中，进行 低速度长时间离心，样品颗粒沉降形成浓度差， 而扩散又使样品颗粒由高浓度区向低浓度区扩散 , 最终达到沉降与扩散的平衡状态。Mr = 2RTln(C2/C1)2(1 V)(x22 x12) 沉降平衡法（四）凝胶过滤法测定 Mr凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术 ， 同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关 :先测得几种标准蛋白质的Ve （ Ve为洗脱体积） ， 并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve， 查标准曲线即可确定分子量 ， 并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的 Ve， 查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测V测（五） SDS-PAGE法测定 Mr聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（ SDS） 时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis1蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围 (1-100 nm)。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素： l 双电层l 水化层a. 丁达尔效应b. 布朗运动c. 不能透过半透膜三、胶体性质与蛋白质的沉淀2蛋白质的沉淀蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。 盐析法（ salting out） ：中性盐（ NH4SO4， NaSO4， NaCl等） 蛋白质脱去水化层。 优点：不引起蛋白质变性。盐溶（ salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增加的现象。 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮） 脱去水化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用。 条件：低温操作，缩短时间。 重金属盐沉淀法： 当溶液 pHpI,蛋白质颗粒带负电荷 ,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等 ) 生成沉淀。 生物碱试剂和某些 酸类 沉淀法：生物碱试剂 能引起生物碱沉淀的一类试剂。 当溶液 pHpI时 ,蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂 ,酸根负离子反应 沉淀用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质 加热变性测定法原因：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层用途：制豆腐（加热 +少量盐卤）1.定义：在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失（如酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用 (denaturation) 。有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结构，这个过程称为复性（ renaturation）。一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化。四、蛋白质的变性与复性化学因素： 强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂、尿素等 物理因素：加热、射线、超声波、剧烈震荡等2. 变性因素l 旋光值改变l 特性粘度增加l 溶解度降低l 扩散系数降低l 结晶能力丧失l 易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点则不一定沉淀l 变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化3.变性后蛋白质的表现变性蛋白质为什么能复性？ 在一定的环境条件下，蛋白质的一级结构能够决定二、三、四级结构。变性蛋白质的二、三、四级结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍然保持不变，因此除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象。 五、蛋白质分离纯化的一般原则l 根据分子量：如沉降速度法离心l 根据密度：沉降平衡法离心l 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳l 根据分子量和分子形状：凝胶过滤l 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀l 根据电荷：等电点沉淀六、蛋白质的分离纯化方法透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。（一）根据分子大小不同的分离纯化方法凝胶过滤法 凝胶过滤（层析）是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。（二）利用溶解度差别的纯化方法影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的 pH、 离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构。等电点沉淀技术：在等电点 pH条件下，蛋白质为电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技术。盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。有机溶剂分级分离法：引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。温度对蛋白质溶解度的影响： 0-40 之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。（三）根据电荷不同的纯化方法电泳 ： 在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。原则上按电泳的原理来分，可分为：l自由界面电l区带电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE） 三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N, N-甲叉双丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=