第三章细胞培养的基本方法

第三章 细胞培养的基 本方法教学目的和要求： 2学时 重点和难点： 掌握细胞培养中无菌操作技术及操作过程中需要注意哪些问题； 预防污染是无菌操作的关键。组织培养中最重要的，也是最基本的要求就是各项操作均 应从无毒害、无污染的培养环境 来考虑。培养基、器皿材料、接种工具、操作环境、培养室和超净工作台等各个环节都应注意。第一节 无菌操作技术一、实验器具等的洗涤和材料的准备培养玻璃器具的洗涤是非常重要的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一遍，烘干；用合适的方法灭菌。二、培养室和超净台的消毒（一）、无菌范畴灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，首先应建立有菌和无菌的概念。有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物表面、超净工作台的台面，未处理的工具、手等。无菌的范畴：物理或化学处理的物体（工具、器皿、培养基等） ；健康的动植物不与外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）。 （二） 无菌操作室，工作前后室内清扫、拖地，以防菌在空气中流动，特别真菌孢子。使用前，室内及超净工作台紫外灯杀菌 30分钟，超净工作台酒精（ 75%）杀菌，工作中一直吹风。三、洗手和着装 工作服、帽子、口罩； 洗手四、无菌操作1、点燃酒精灯，所有操作均在火焰 近处 并经过 烧灼 进行；2、 冷却 后才能使用；3、操作时，打开试管盖，要进行烧灼灭菌，但是时间要 短 。在火焰上烧瓶口。保证容器倾斜 。 4、进行操作时动作要 准确敏捷 ，但是不宜太快，防止空气流动，增加污染的机会； 5、超净工作台上的器具和用品要 摆放合理； 6、操作时器具不能触及瓶口以防止污染； 7、不要说话接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中正 确 错 误 整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正 确 错 误 防止操作带来的污染接种 过 程中尽可能达到 悬 空要求正 确 错 误 正 确 错 误 接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正 确 错 误 接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正 确 错 误 接种茎段：注意形 态 学下端插入培养基内，而形态 学上端露于空气中正 确 错 误 污染材料应及时清除，高压灭菌。菌有两种，细菌成粘液状，真菌有菌丝。 特别真菌危害极大。五、使用超净台注意事项 1、超净台安装在清洁无尘的房间内，最好为隔离的无菌间，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命； 2、长期未使用或新安装的超净台使用前必须对工作台和周围环境进行清扫，再采用化学灭菌或紫外线灭菌法进行灭菌处理； 3、使用前用 75酒精擦洗台面，并提前用紫外线灭菌 30min。关闭紫外灯后应启动鼓风机运转几分钟后再进行培养操作； 4、净化工作区不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰； 5、用后工作台要用 75酒精擦洗，以备后面工作人员使用； 6、及时更换滤器。条件：温度：依培养对象选择合适的温度。光照：光照时间和光照强度1 培养架 放置培养物2空调 调节温度3配电板 设熔电器和开关，用以管理室内的电源4时控器 自动