白斯古楞论文答辩

论文答辩欢迎各位老师指导抗癌活性肽对大肠癌 LOVO细胞及相关凋亡基因的影响 学 科 专 业：外科学导 师 姓 名：王茂春 教授指 导 教 师 : 苏秀兰 教授研 究 生 姓 名 ： 白斯古楞前言n 大肠癌为人类常见的恶性肿瘤之一，病死率极高。 在我国的发病率有大幅度提高 ，病死率也不断上升，已经位居恶性肿瘤死亡率的第 4 5位 3,4 。目前大肠癌的治疗还是以手术治疗为主，但即使结直肠癌病人接受了根治性手术，复发率仍较高，而再次手术的机会又很小 5。大肠癌的高发病率与相对低存活率表明对其需要一种更有效的治疗策略，需要积极探索大肠癌生物治疗的新方法，以提高患者的生存质量，延长生命，为全身治疗创造条件。n 抗癌活性肽（ Anticancer bioactive peptide， ACBP)是一种天然活性物质 ,相对分子质量小于 800kd，属于小分子多肽13,14,15 。 具有抑制肿瘤细胞增殖和激活免疫系统的双重作用，大量体外细胞实验和动物体内试验证明， ACBP能够抑制胃癌，卵巢癌，鼻咽癌，胆囊癌等多种肿瘤细胞的 DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡和分化，降低肿瘤患者血液粘稠度，改善微循环，调节患癌机体无氧糖酵解，提高机体免疫力。n P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高，研究最广泛、深入的基因之一。 p53分为野生型 (wild-type p53,wtp53)和突变型(mutant-type p53,mtp53） 7 。野生型p53 对细胞的分裂和增殖起负调控作用，是抑癌基因。而 p53蛋白由于不稳定，易发生突变，一旦 p53发生突变，就会丧失野生型 p53 基因所具有的细胞周期停滞、诱导凋亡发生、介导细胞衰老、维持基因稳定和错配基因修饰等抑癌功能，同时获得许多癌基因的特殊功能。 n Bcl-2基因家族分为两大类：一类是抗凋亡蛋白，另一类是促凋亡蛋白 8。 bcl-2、Bcl-xl属于 Bcl-2基因家族成员中抗凋亡蛋白一类。 bcl-2基因能抑制细胞凋亡而延长细胞的寿命，但不能促进细胞增殖，即细胞凋亡抑制基因。n Bcl-xl基因是近几年发现的 Bcl-2家族成员的代表，为抑制凋亡的蛋白，在人体各组织中均有表达 11。 Bcl-xl功能与 bcl-2相似，能与 Bak蛋白一起形成异二聚体，来中和 Bak蛋白的促凋亡作用，从而抑制细胞的凋亡。 研究目的 探讨抗癌活性肽（ ACBP）对大肠癌细胞株的凋亡和 p53、 bcl-2、 Bcl-xl基因表达的影响，进一步完善抗癌活性肽对大肠癌细胞的抑制作用机制，证实其对大肠癌细胞有生长抑制的作用。 实验路线图体外培养大肠癌 lovo细胞分为 NS、 5-FU、ILP三组倒置显微镜下观察细胞凋亡RT-PCR方法检测p53、 Bcl-2 、 Bcl-xl基因的表达得出结论 统计学处理取 3-4代的细胞作用 24h实验方法n 体外培养人体大肠癌 lovo细胞株 n 实验分组：将大肠癌 lovo细胞株常规复苏 ,放入在 37 、 5% CO2,饱和湿度的培养箱中培养。 24小时更换 DMEM培养基一次 ,待细胞融合时用 0.25%胰蛋白酶消化传代 ,取 3-4代的细胞，分别加入生理盐水 ( 0.5mL，对照组 )、 5-FU ( 0.5mL，阴性对照组 ) 、抗癌活性肽 ( 0.5mL，用药组 ) n 用药 24h后倒置显微镜下观察各组 lovo细胞形态学改变。n 收集细胞加入 1ml的 Trizol n 提取总 RNAn 细胞总 RNA鉴定： 1的琼脂糖电泳来鉴定细胞总 RNA，观察出现的各个条带及条带亮度。 n 总 RNA提取步骤：收集细胞，加入 1ml的 Trizol 室温静置 5min加入氯仿 0.2ml/管 室温静置 5min上清液转至新离心管漩涡振荡 30s后离心 弃上清，加入 1ml75%乙醇洗涤室温静置 10min弃上清，保留沉淀溶解于适量的 DEPC水中冰上放置 5min 12000g， 4 ，离心 5min剧烈震荡混匀 一般 500ml洗两次12000g， 4 ，离心 5min12000g， 4 ，离心 5min12000g， 4 ，离心 5min12000g， 4 ，离心 3min室温晾干加入等体积异丙醇，上下颠倒n DU800紫外分光光度计测定：分别测定细胞的总 RNA光密度值 (OD)在 260nm和 280nm处的,并计算 RNA的含量和纯度。要求RNAOD260/OD280值在 1.5-2.0之间，浓度在500ug/ml以上的符合实验条件。n RT-PCR半定量方法检测抗癌活性肽（ ACBP）对大肠癌 lovo细胞 p53、 bcl-2、 Bcl-xl基因表达的影响。n RT反应液配置试剂 使用量 5PrimeScriptBuffer 4 l PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1 l Oligo dT Primer（ 50 M） 1 l Total RNA 根据浓度计算体积 RNase Free dH2O up to 20 l注： Total RNA用量为 1ug 。n 反转录反应条件如下 : 37 15 min *3（反转录反应） 85 5 sec（反转录酶的失活反应）n PCR反应液配制（ 15ul） 试剂 使用量 5PrimeSTARBuffer（ Mg2+ plus） 3.00 l dNTP Mixture（各 2.5 mM） 1.20 l Primer 1（ 10 M） 0.20 l Primer 2（ 10 M） 0.20 l cDNA产物（ 10 pg/l） 3.00 l PrimeSTARHS DNA Polymerase 0.15 l 灭菌蒸馏水 up to 15.00 l n PCR引物详细序列 Sequence(5to3) Product(bp) Tm p53 F ATGAAGCTCCCAGAATGCCA 264 52 p53 R AATCAACCCACAGCTGCACA 264 52 Bcl-xl F CCTGCCTGCCTTTGCCTAA 244 53 Bcl-xl R TAAACTGACTCCAGCTGTATC 244 53 bcl-2 F GGTGCCACCTGTGGTCCACCT 261 55 bcl-2 R CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG 261 55 GAPDH F CCTCAACGACCACTTTGTCA 103 50-60 GAPDH R TTACTCCTTGGAGGCCATGT 103 50-60n PCR反应条件如下 ：94 5min 1 Cycle94 30sec 52 、 53 或 55 * 15sec 25 Cycle72 30sec 72 7min 1 Cycle4 保存注： p53退火温度为 52摄氏度， bcl-2退火温度为 55摄氏度 , Bcl-xl退火温度为 53摄氏度。 n 实验采用 GAPDH片段作为内参照。 P53、 bcl-2、 Bcl-xl、 GAPDH引物采用 Oligo软件进行设计，由 invitrogen公司合成。n 琼脂糖凝胶电泳 ：取 PCR产物 5ul，加5xLoading Buffer 2ul， 2%琼脂糖凝胶电泳 110V， 100mA， 25min，凝胶成像仪成像并保存结果。n 凝胶图像分析软件半定量分析测定灰度值。统计学分析n 实验数据采用 表示，组间比较采用t 检验，两组以上比较采用方差分析，SPSS13.0 统计软件进行统计学分析。P 0.05 为差异有统计学意义。实验仪器及设备分光光度仪 培养箱 显微镜超净台 低温超速离心机 实验结果n 加入生理盐水 24h后见 lovo细胞生长旺盛 ,形态良好呈梭形或多角形，胞质均匀透明，随时间延长变化不大 。用药前和用药 24h后（倒置显微镜下， 100 ， x400） 生理盐水组n 加入 5-FU 24h后见lovo细胞数量减少，部分细胞变小、变圆、折光率减弱、核浓缩等细胞凋亡形态。用药前和用药 24h后（倒置显微镜下， 100 ， x400）5-FU组 n 加入 ILP 24h后见lovo细胞数量减少，部分细胞变小、变圆、折光率减弱、核浓缩等细胞凋亡形态。用药前和用药 24h后（倒置显微镜下， 100 ， x400）抗癌活性肽组 n 细胞总 RNA1琼脂糖电泳细胞总 RNA1琼脂糖电泳可见清晰的两条条带，分别为18S和 28S。 n 紫外分光光度计测定： 分别测定细胞总 RNA在 260nm和 280nm处的光密度值 (OD),并计算 RNA的含量和纯度。数据显示 RNA纯度均在 OD260/OD280比值 1.5-2.0之间，浓度在 400-2500ug/ml之间，符合 RT-PCR实验条件。 n RT-PCR检测 p53基因 RNA水平表达：ACBP组与组与 5-FU组组 p53基因基因 RNA表达水平明表达水平明显低于显低于 NS组组 p53基因基因RNA表达。表达。p53 RT-PCR电泳图 n RT-PCR检测 bcl-2基因 RNA水平表达： ACBP组与组与 5-FU组组 bcl-2基因基因 RNA表达水平表达水平明显低于明显低于 NS组组 p53基基因因 RNA表达。表达。bcl-2 RT-PCR电泳图 n RT-PCR检测 Bcl-xl基因 RNA水平表达： ACBP组与组与 5-FU组组Bcl-xl基因基因 RNA表表达水平明显低于达水平明显低于 NS组组 p53基因基因 RNA表达表达。Bcl-xl RT-PCR电泳图 n 在 ACBP组、 5-FU组和 NS组中 GAPDH的表达GAPDH RT-PCR电泳图 在在 ACBP组、组、 5-FU组和组和 NS组中组中 GAPDH均有表达均有表达n 大