第二章植物组织培养的基本技术与设施

第一节 植物组织培养的操作方法概述一、外植体的选择二、外植体的灭菌 三、外植体的接种和培养四、外植体的成苗途径五、污染的原因及其预防措施六、外植体的褐变及其防止措施七、培养物的玻璃化现象及其防止措施八、试管苗的驯化与移栽J 外植体（ Explants）： 指植物离体培养的各种接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。一、 外植体的选择J 外植体的选择依据J 优良的种质J 健壮的植株J 大小适宜的外植体J 适宜的发育时期J 适宜的部位J 适宜生理状态和发育年龄的器官J 细胞培养材料的选择（ 二 ） 外植体灭菌的一般步骤 二、外植体的灭菌（一） 常用灭菌剂的使用及其效果（三）各种外植体的灭菌方法（一）常用消毒剂消毒 剂 使用 浓 度（） 去除的 难易 消毒 时间 （分） 效果次 氯 酸 钙次 氯 酸 钠漂 白 粉溴 水过 氧化 氢升 汞酒 精抗 菌 素硝 酸 银9 102饱 和溶液1 210 120.1 170 754 5（ mg/L）1易易易易最易较难易中较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较 好好自 :曹孜义（二） 外植体灭菌的一般步骤3. 将适当浓度的消毒液 (0.1%升汞或 2%次氯酸钠 )(含有几滴活化剂 Tween20或 Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须把玻璃瓶摇动 2 3次。 4消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复 3 4次。1预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌。 2将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入 75%的酒精溶液埋没材料，浸泡 10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。1、茎尖、茎段及叶片等的消毒消毒前要经自来水较长时间的冲洗。消毒时要用 70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗 2 3次，然后用 2% 10%的次氯酸钠溶液浸泡 10 25min， 若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温 -80，或者用 0.1 0.2升汞浸泡消毒 5 10分钟消毒后，用无菌水冲洗 3次后方可接种。2、果实及种子的消毒用自来水冲洗 10 20分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。果实用 2%次氯酸钠溶液浸 10min后，用无菌水冲洗 2 3次。种子要先用 10%次氯酸钠浸泡 20 30min甚至几小时。对难以消毒的还可用 0.l%升汞或 1% 2%溴水消毒 5min。胚或胚乳培养时，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用 4%10%的次氯酸钠溶液浸泡 8 10min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。 （三）几种外植体的灭菌方法70酒精擦洗花蕾，或浸泡数秒钟饱和漂白粉上清液：浸泡 10分钟；或次氯酸钠液 2 5： 8 10分钟无菌水冲洗几次后，吸去水分，剥取花药或胚珠接种。3、花药的消毒预先用自来水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。可采用 0.1% 0.2%升汞 浸 5 10min或 2%次氯酸钠 溶液浸 1015min， 然后以无菌水冲洗 3次，用无菌滤纸吸干后可接种。4、根及地下部器官的消毒三、外植体的接种和培养（一）无菌操作（二）外植体的培养植物组织培养的接种： 把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程，是一种无菌技术。在操作过程中引起的 污染来源： 主要是由材料本身带菌和工作人员本身引起的。 （一）无菌操作 污染的主要来源 是空气中的细菌和真菌孢子每次接种前半小时地 面 ：用 70酒精喷雾使空气的灰尘沉降。紫外线灯照射 20分钟。工作台面要用 新洁尔灭或酒精擦洗 。 1、接种室的消毒入无菌室前，要洗手。 l%新洁尔灭溶液内 5分钟入室时要穿上经过 消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子 等。操作前要用 70%酒精擦洗手 ，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把 工具在火焰上消毒 。必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。2、工作人员要求 切取和接种 较大的材料肉眼观察即可操作分离， 较小 的材料需在 双筒解剖镜下 操作。分离工具一定要放好，切割动作要快，防止挤压 使材料损伤而失败。 接种时要防止交叉污染的发生3、材料的切取酒精擦拭手外植体消毒浸泡 5min器械消毒酒精灯灼烧4、 接种的具体操作旋转灼烧 取外植体接种 盖好瓶塞1、培养条件： 温度： 常保持在 232 ，夜温低 12 光照时数 ：大多数情况下为 16h（ 暗培养不需要光照，例如起始培养的前几天不需要光照） 光照强度 ： 10003000 lx， 白色荧光灯，光的作用是满足形态建成的需要（诱导） 相对湿度： 培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调整培养间湿度 （二）外植体培养接种后 3 7天内，主要是检查其 污染 情况。增殖、继代培养，建立了无菌培养系。细胞学观察：一般每隔 3 5天观察一次。及时记录。观察方法根据培养方式灵活掌握：可用显微镜进行定点观察如平板培养可用倒置显微镜观察如液体培养2、定期检查和细胞学观察1外植体先形成愈伤组织，再分化成完整的植株。四、外植体的成苗途径2胚状体发生3外植体经诱导后直接形成根与芽，发育成完整的植株4原球茎型 -图片石斛兰的原球茎外植体愈伤 组织根、芽芽 根根 芽胚状体根、芽试管苗外植体的成苗途径不定芽形成-多细胞参与胚状 体形成过程 -单细胞参与 体细胞胚的发育过程低 CTK/IAA外植体 愈伤 组织芽根脱分化再分化低CTK/IAA根完整植株生长调节物质控制器官分化的模式芽高 CTK/IAA低 CTK/IAA五、污染的原因及其预防措施污染 概念：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。原因：细菌菌斑呈黏液状物。除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外，操作人员的不慎也是造成细菌污染的重要原因。因此接种人员的手应经常用 70酒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。真菌污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后 3 10d才能发现，造成真菌污染的原因多为周围环境的不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养瓶的口径过大、操作不慎等途径： 外植体带菌； 培养基及器皿灭菌不彻底； 操作人员未遵守操作规程等。防止材料带菌的措施 用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。避免阴雨天在田间采取外植体。对于材料内部污染的材料采取特殊方法。 外植体的灭菌 多次灭菌法 多种药液交替浸泡法金属器械的灭菌一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在 95的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。布质制品的灭菌 :工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品，放入高压灭菌器中，在压力为 108kPa，温度为 121 的情况下，灭菌 20 30min无菌操作室的灭菌 : 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用 2的新洁尔灭或 70的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约 20min。使用前用 70的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸 。操作人员 污染的预防措施六、外植体的褐变及其防止措施（一）褐变的原因1.基因型2.外植体的生理状态 3.培养基的成分 无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转移时间过长。（二）褐变的防止措施1.选择适宜的外植体 2.最佳培养基 3.连续转移 4.加抗氧化剂 5.活性炭 七、培养物的玻璃化现象及其预防措施（一）玻璃化现象 叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。激素浓度 激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高 )。琼脂浓度 琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重。温度： 适宜的温度可以使试管苗生长良好。光照时间多数植物在 10 12h光照下都生长良好，大于 15h时，玻璃化苗明显增加。通风条件愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。愈伤组织和试管苗长时间培养，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。 组织培养所用瓶盖棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气较好，玻璃化苗的比例较低。 离子水平培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。（二）产生玻璃化苗的因素适当控制培养基中无机营养成分；适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度；适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度；增加自然光照，控制光照时间；控制好温度；改善培养器皿的气体交换状况在培养基中添加其他物质，加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化。如添加马铃薯汁液法可降低油菜玻璃苗的产生频率；0.5mg L多效唑或 10mg L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；1.5 2.5g/L的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化 。加入 0.3的活性炭还