细胞电生理学与膜片钳技术1

cell electrophysiology & patch clamp techniques小林 /forry 祝你科研学习顺利1991 Nobel基金会的颁奖评语：膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为 细胞生理学 的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学1、细胞电生理学OUTLINE细胞电生理学 Electrophysiology细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动测量离子、离子通道细胞兴奋生物电信号 细胞生理学膜的 “流动镶嵌模型 ”细胞膜和离子学说建立（ Hodgkin， et al . 1946年 ）磷脂双层的屏蔽作用Na-K 泵K+o Na+i离子的跨膜分布离子的跨膜分布离子通道 (ion channels) 离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（ K+、 Na+、 Ca2+等 ）能 选择通透 ，其功能是 细胞生物电活动 的基础。特性： 通透性（ permeation ）选择性（ selectivity）门控性（ gating）研究技术：膜片钳技术和分子克隆技术 配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阴离子通道：甘氨酸和 氨基丁酸受体通道蛋白通道蛋白 离子通道离子通道乙酰胆碱受体 电压门控通道 ： 钾、钠、钙离子通道通道蛋白通道蛋白 离子通道离子通道电压门控钾离子通道 环核苷酸门控通道 气味分子与 G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，产生 cAMP，开启 cAMP门控阳离子通道（ cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，最终形成嗅觉或味觉。 机械门控通道 一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 水通道 2003年诺贝尔化学奖：Pete Agre、 Roderick MacKinnon通道蛋白通道蛋白 离子通道离子通道2、膜片钳技术及其应用3、离子通道药理学 1、细胞电生理学OUTLINE 电生理学研究简史： 二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。 1825年， Nobili发明了电流计，用其证实了肌肉有电流存在。 1912年， Bridge 确定了 AP的 “全或无 ”现象。同年， Oxford提出了突触的概念及反射弧的生理学研究，获 1932年 Nobel奖。 1937年， Hodgkin和 Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，获 1963年Nobel奖 。 1946年，凌宁和 Gerard创造拉制出尖端直径小于 1m的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动 。 玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。 Voltage clamp（ 电压钳技术）由 Cole和Marmont 发明，并很快由 Hodgkin和 Huxley完善，真正开始了定量研究，建立了 H H模型（膜离子学说 ),是近代兴奋学说的基石。 1948年， Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位； 1969年，又证实 N M接触后的Ach以 “量子式 ”释放，获 1976年 Nobel奖 。 1976年，德国的 Neher和 Sakmann发明 Patch Clamp（ 膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起的通道电流。 1980年， Sigworth、 Hamill、 Neher等在记录电极内施加负压吸引，得到了 10100 G的高阻封接 (giga seal)， 大大降低记录噪声，实现了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。获 1991年 Nobel奖 。History of Ion Channel Study 1955年， Hodgkin和 Keens应用 电压钳 (Voltage clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现，放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞的运动，并提出了 “ 通道 ” 的概念。 1963年，描述电压门控动力学的 Hodgkin-Huxley模型（简称 H-H模型），荣获诺贝尔医学 /生理学奖。 1976年， Neher和 Sakmann建立膜片钳 (Patch clamp)技术。 1983年 10月， Single-Channel Recording 一书问世，奠定了膜片钳技术的 里程碑 。 1991年， Neher和 Sakmann的 膜片钳技术荣获诺贝尔医学 /生理学奖。1963年诺贝尔生理学 /医学奖发现了 神经细胞膜的周边和中央部分与兴奋和抑制有关的离子机制艾克尔斯Sir John Carew Eccles澳大利亚澳大利亚国家大学1903年 -1997年 霍奇金Alan Lloyd Hodgkin英国英国剑桥大学1914年 -1998年赫克斯利Andrew Fielding Huxley英国英国伦敦大学1917年 -The Nobel Prize in Physiology or Medicine(1991) Erwin Neher Bert Sakmann 1/2 of the prize 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr Biophysikalische Chemie, Goettingen, Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr medizinische Forschung, Heidelberg, Federal Republic of Germany b. 1944 b. 1942膜片钳技术 膜片钳技术：从一小片 (约几平方微米 ) 膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定 电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流， 从而了解离子运输、信号传递等信息。基本原理 利用负反馈电子线路 ,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上 ,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察 ,从而研究其功能。膜片钳技术实现膜电位固定的 关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成 高阻 （ 10 ） 密封 ,使电极尖端开口处相接的细胞膜片与周围环境在电学上隔离 ,并通过外加命令电压钳制膜电位。由于玻璃微电极尖端管径很小 ,其下膜面积仅约 1 2,离子通道数量很少 ,一般只有 一个或几个通道 ,经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少 ,可以忽略 ,也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略 ,那么 ,只要保持电极内电位不变 ,则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变 ,从而实现电位固定。膜片钳技术的优点 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外 ,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。膜片钳记录的各种模式 根据膜片与电极之间的关系，可将膜片记录主要分为种模式 。首先建立的单通道记录法（ Singl