细胞科学报告选题20111112

转基因动物转基因动物n 1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的 “超级小鼠 ”。n 按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等。转基因动物技术n 概念n 研制的方法n 技术的优点n 发展前景含外源基因的载体基因微注射 移植受精卵小鼠出生转基因鼠的检测繁殖后代转基因动物n 一、转基因动物概述n （一）转基因动物概念n 转基因动物是指通过基因工程对 DNA进行体外操作，添加或删除一个特殊的 DNA序列，然后导入早期的胚胎干细胞中，产生遗传结构得以修饰的动物，其改变的性状可以遗传给后代。n 这些改变包括：n （ 1）外源 DNA片段至少整合到一条染色体上；n （ 2）由于外源 DNA的插入使任何一个基因发生改变；n （ 3）由于外源 DNA的插入或内源基因的删除使染色体发生重排；n （ 4）有意识地导入可以持久存在的遗传实体。（二）转基因动物的命名n 1符号n (1)一个转基因符号由以下三部分组成：q TgX (YYYYYY) Zzz，n TgX=方式；n (YYYYYY)=插入片段标示；n = 实验室指定序号；n Zzz = 实验室注册代号； (2) 方式转基因符号通常冠以 Tg字头。随后的一个字母（ X）表示 DNA插入的方式：H 代表同源重组；R 代表经过逆转录病毒载体感染的插入；N 代表非同源插入。（ 3）插入片段标示An 匿名序列； Ge 基因组；Im 插入突变； Nc 非编码序列；Rp 报告基因； Sn 合成序列；Et 增强子捕获装置； Pt 启动子捕获装置。 2.举例C57BL/6J-TgN(CD8Ge) 23 Jwg：来源于美国杰克逊研究所（ J）的 C57BL/6品系小鼠被转入人的 CD8基因组（ Ge）；转基因在 Jon W.Gordon (Jwg) 实验室完成，获取于一系列显微注射后得到的序号为 23的小鼠。 二、转基因动物的基本原理和方法n （一）基本原理将改建后的目的基因用显微注射等方法注入实验动物的受精卵，然后将此受精卵再植入受体动物的输卵管中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过转入外源基因培育优良品种的工程动物等。1.外源目的基因的分离2.外源目的基因与转性基因表达启动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组3.重组 DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞4.胚胎移植技术5.鉴定及筛选6.目的基因整合率及表达效率的检测（二）转基因动物的关键技术1.采取受精卵采取受精卵的方法分为获得自然排卵的受精卵的方法和以激素诱发排卵的方法，还有采取未受精卵，然后在体外受精的方法 。2.向受精卵雄性原核注入 DNA溶液通过微分干涉显微镜观察受精卵，会看到两个大的原核。两个核不久即可融合，接着核膜消失。雄性原核要比雌性原核能容纳更多的 DNA溶液，一般是向雄性原核注入 DNA溶液。3.向假妊雌小鼠移植（ 1）假妊雌小鼠的制作（ 2）将操作卵移植至输卵管4.转基因动物的检测 显微注射法 逆转录病毒法 原理：逆转录病毒的核酸为一条单链 RNA分子，其基因由两部分组成，一是顺式作用序列，为病毒复制和整合所必需；二是反式作用序列，编码病毒的包装蛋白。将外源基因取代 反式作用序列 构建成重组载 DNA。另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。如果重组病毒 DNA导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将 DNA包装成具有感染力的重组蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组 DNA引入宿主细胞。 逆转录病毒法步 骤 ：1.逆 转录 病毒 载 体的构建2.选择 和培养包装 细 胞系3.重 组 病毒 DNA导 入包装 细 胞4.收集重 组 病毒 颗 粒5.感染胚 细 胞，使 细 胞 转 化此法是目前制 备转 基因 鸡最有效和最成功的方法。 胚胎干细胞法胚胎干细胞是在人（哺乳动物）胚胎发育早期 囊胚（受精后约 57 天）中未分化的细胞。囊胚含有约 140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。 由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程1. 3.5天的孕鼠2.分离胚细胞3.转入培养皿中培养4.分离内层细胞团5.收集干细胞克隆6.酶处理解散细胞7.培养干细胞8.转染干细胞9.植入代孕母鼠体内在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术2007年诺贝尔生理学或医学奖分别授予两名美国人马里奥 卡佩基、奥利弗 史密斯和一名英国人马丁 埃文斯，以表彰他们在 “基因靶向 ”技术方面的突出贡献。诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，三位科学家 “在涉及胚胎干细胞和哺乳动物重组方面有着一系列突破性发现 ”，为 “基因靶向 ”技术的发展奠定了基础。在 “基因靶向 ”技术的帮助下，科学家可以使小鼠体内的特定基因丧失功能。此类 “基因敲除 ”试验可以帮助人们了解基因在胚胎发育等多种现象中发挥何种作用。 “基因靶向 ”技术为阐明人类疾病的发生机理方面发挥了至关重要的作用 。在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术基因打靶是指通过 DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在 胚胎干 (ES)细胞技术 和 同源重组技术 成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。 通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括 基因灭活 、 点突变引入 、 缺失突变 、 外源基因定位引入 、 染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。 精子载体法精子载体法是精子和外源 DNA混合培养时，外源 DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。外源 DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法 。 体细胞核移植法1997年，英国科学家 Schnieke和 Wilmut等通过体细胞核移植技术成功克隆了 “多莉 ”。1997年 6月 Wilmut报道用胚胎细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子 IX转基因克隆绵羊 “波莉 ”。1999年，美国科学家Alexander克隆了头山羊，改变了它们的基因性状，使它们的乳液内含有一种对心脏病具有疗效作用的蛋白质。 受体介导法是将外源 DNA与受体分子连接后与胚胎细胞共培养，受体可以介导外源DNA进入受体细胞，从而实现基因转移。1999年， Ivanava用受体介导法制作了转基因鼠。提高转基因效率的策略1、对外源基因的整合机制进行深入研究，避免基因的随机整合，提高基因的表达效率。2、建立更完善的转基因方法。利用胚胎干细胞介导可以进行基因表达的体外选择，是提高转基因效率的有效方法。3.探索有效的阳性胚胎筛选方法。4.使用大的外源 DNA片段。5.选择表达效率高的启动子。6.其它 DNA顺序的影响。如顺式调控区元件等。三、转基因动物的应用n （一）提高动物优良性状、改善动物产品质量n （二）动物抗病育种n （三）生产药用蛋白n （四）生产人用营养保健品n （五）生产可用于人体器官移植的动物器官n （六）建立诊断、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型技术优点1.转基因动物可以提高生产能力。（ 瘦肉型猪 ）2.转基因能增强抗病能力。（转基因鲑鱼）3.转基因能生产生物医学产品。（转基因猪生产人血红蛋白）技术的忧患1.基因污染：人工组合的基因，可能会通