第二节基因工程的基本操作步骤

第二节基因工程的基本操作步骤基因工程的核心：让目的基因在宿主细胞中稳定存在和高效的表达看视频总结基因工程需要哪些步骤？获得目的基因形成重组 DNA分子将重组 DNA分子导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达基因工程基本操作步骤一、获得目的基因1、目的基因较小且序列已知 用化学方法直接人工合成。2、目的基因的全部或部分序列已知 用聚合酶链式反应（简称 PCR）技术扩增3、目的基因的序列是未知的 从基因文库中获取目的基因 用某种限制酶切成多个片段 提取某种生物的 DNA第一步：建立基因文库（一般已做好） 将片段与载体连接起来 导入受体菌（常用大肠杆菌）群体中基因文库第二步：从基因文库中获取目的基因 根据目的基因的产物等特性，用原限制酶将目的基因切下。 用与切下目的基因的 同种 限制酶切开载体 DNA二、形成重组 DNA分子 用 DNA连接酶连接目的基因和载体 DNA，形成重组 DNA分子。（重组质粒或重组病毒）三、将重组 DNA分子导入受体细胞构建重组质粒四、筛选含有目的基因的受体细胞在含有四环素的选择培养基上培养目的基因抗四环素基因导入只有含重组 DNA分子的细胞能生长抗四环素基因抗氨苄青霉素基因与目的基因两侧相同的酶切位点 含目的基因含四环素的培养基 含氨苄青霉素的培养基含目的基因五、目的基因的表达受体细胞是原核细胞时，目的基因可留在质粒上；受体细胞是真核细胞时，目的基因必须插入染色体DNA。 检测目的基因是否插入了受体细胞染色体 DNA中 DNA分子杂交技术将 DNA固定在膜上，加热解旋将带有放射性同位素标记的含目的基因的 DNA片段（ 探针，一般为单链 ）加到膜上提取受体细胞基因组 DNA一段时间后冲洗检测膜上是否有杂交带（放射性） 检测目的基因是否转录 分子杂交技术固定在膜上的变成 mRNA，探针与 相同 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗原 -抗体杂交 检测生物个体是否出现相应性状活动：完成 “基因工程操作程序的模拟操作 ”思考：基因工程的理论基础是什么？原核生物界原生生物界植物界 动物界真菌界DNA的结构和功能转录翻译遗传信息的表达机制相同整个生物界共用一套密码子二、基因工程的理论基础 DNA的结构相同（双螺旋结构） DNA功能相同（即复制方式和表达机制相同） 整个生物界共用一套密码子哪些技术能保证基因工程能够实施？获得目的基因形成重组 DNA分子将重组 DNA分子导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达工具 ? 限制酶DNA连接酶载体 :质粒、病毒（ 3）蛋白组分析蛋白质合成后，还要进行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白质剪切等翻译后修饰，仅从核酸的序列并不能完全描述一个蛋白质。尽管分析不同细胞类型中表达的蛋白已近 20年，直到 1995年才由 Wilkins 和 Williams 提出一个与基因组相对应的名词蛋白组分析的核心技术是蛋白质双向电泳。技术上三大发明：（ 1） 基因转移载体的发现 1967， T.F.Roth&D.R.Helinski， 发现质粒的自我复制能力，并能够在细菌之间转移 。基因是可以转移的。（ 2） 工具酶的发明 1972 H.C. Smith 、 W.Arber & D.Nathans从流感嗜血杆菌中分离得到限制性内切酶；1970年， 逆转录酶的发现使真核细胞的 基因制备成为可能；此后，多种限制酶和连接酶发现。 基因是可切割的。（ 3） DNA体外重组的实现 1972年， 美 Berg 第一次构建出了体外重组 DNA分子。重组 DNA表达实验的成功 1973， H.Boyer & S.Cohen选用仅含单一 EcoRI酶切位点的载体质粒 pSC101， 使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的 DNA片段重组。重组的DNA转入大肠杆菌 DNA中，转录出相应的 mRNA。 基因工程诞生元年技术进一步推动基因工程的发展 ：（ 1） 第一例转基因动物和转基因植物问世 1980 科学家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。 1983，科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。（ 2） PCR技术的发明 1988年， 美 K.Mullis发明PCR技术，使基因工程进一步发展。The Nobel Prize in Chemistry 1993“for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method“Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA 为了将上图的目的基因与左图的质粒结合，应该用_限制酶切开质粒，这是为了保证目的基因两端与质粒露出的 _能够碱基互补配对，之后在 _作用下才能够牢固结合，形成一个 _。将重组质粒导入受体细胞后，受体细胞将获得 _能力 。EcoR.1切点Hand.3切点Ta