第五章第三节——五电泳分离

Electrophoresis Theory , Methods and Aplications五、电泳技术五、电泳技术电泳的概念电泳是指带电颗粒在电场作用下 ,向着与其电荷相反的电极移动的现象。v 分辨率高，可以对混合物进行电泳分析，甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电泳带。v 方法温和，对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便、可靠，甚至可作为具有一定规模的制备方法。电泳的特点一、基本原理一、基本原理当带电粒子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。（一）基本原理电泳阻滞力 电场强度 物质离子在电场中 差速迁移 是电泳分离的基础。（二）影响电泳速度的相关因素1. 颗粒性质 ：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗粒的 净电荷量成正比 ，与 颗粒的半径成反比 。2. 电场强度 ： E 愈高 ，带电颗粒的泳动 速度愈快 。3. 溶液性质 ： pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快；离子强度 在 0.02 0.2为宜 ;泳动速度与 溶液黏度 成反比。-SO4-SO4-SO4-SO4COO-Na+Na+吸附的反离子固定基团4.电渗 是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗 方向一致 时， 加快颗粒的泳动速度 ；当颗粒的泳动方向与电渗 方向相反 时，则 降低颗粒的泳动速度 。5.焦耳热 电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当 电场强度或电极缓冲液离子强度增高 ，电流强度也增加，不仅 降低分辨率 ，严重时甚至烧断或熔化支持介质。6.筛孔 在 筛孔大 的凝胶中溶质颗粒的 泳动速度快 。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide gel electrophoresis （ PAGE ）v以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、等电点及分子构型。v聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 ： 孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。 机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。 电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分子的制备。1. 聚丙烯酰胺凝胶的合成丙烯酰胺N,N-甲基双丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶催化剂聚合反应凝胶丙烯酰胺和双丙烯酰胺量的确定烯溶液浓溶液交联剂交联剂结点结点TEM(投射电镜 ) image of a polyacrylamide(聚丙烯酰胺 ) 2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素（ 1）化学聚合： 以过硫酸铵（ AP）为 催化剂 ，以四甲基乙二胺（ TEMED）为 加速剂 ，使丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺发生连锁反应，形成网状的聚合物。vpH：在 碱性 pH 时，反应速率 高 ；而在 酸性 条件时，同样浓度溶液，聚合速率 减慢 。v温度：在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在 25 聚合的凝胶则较透明和有弹性。vO2： O2使过硫酸铵（ AP）分解。（ 2）光聚合： 以核黄素为催化剂在少量的氧存在下,分解成无色的还原型，在少量的 O2条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。核黄素 B1 还原型 游离基 聚合反应光照 O2v 优点：用量少。 聚合的时间可以自由控制。v 缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好。光聚合适合于大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合于各种凝胶的聚合。+蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素蛋白质的电荷量起主要作用蛋白质的分子大小起主要作用蛋白质分子的构型起主要作用三 .不连续凝胶电泳的分离原理系统的不连续性表现在以下几个方面：v凝胶系统的不连续性： 上层为大孔径的 浓缩胶 ，下层为小孔径的 分离胶 。v缓冲液离子组成及 pH的不连续性： 电极缓冲液为 pH8.3的 Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的 Tris-HCl缓冲液，而分离胶为 pH8.9的 Tris-HCl缓冲液。（一）原理在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的 浓缩效应 ，凝胶的 分子筛效应 和 电荷效应 ，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。v电位梯度的不连续性mCl- aCl- m蛋蛋 - a蛋蛋 - mGly- aGly-1. 浓缩效应Cl-：快离子； Gly-：慢离子v 电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低的区域，该区域为的区域，该区域为 低电导区低电导区 。v 电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一个迅速移动的界面。个迅速移动的界面。v样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为一个狭窄的中间层（浓缩一个狭窄的中间层（浓缩 300多倍）。多倍）。2.分子筛效应移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的 pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，迁移率超过蛋白质分子，随之高电场强度消失。当蛋白质分子量和构型不同时，通过分离胶所受到的阻滞程度不同，导致泳动率不同，结果依据分子量的大小而分开。3.电荷效应蛋白质所带电荷不同，泳动率也不同，故在同一电场强度中，单位时间内各分子迁移的距离存在差异。因此，蛋白质样品经分离胶电泳后，若样品组分的分子量相同，则它们将按电荷顺序排列，从而导致分离。（二 ) 操作垂直柱状、板状的不连续凝胶电泳系统组成和配制样品的准备加样电泳检测1. 不连续凝胶电泳系统的组成和配制（ 1）缓冲液系统 浓缩凝胶缓冲液0.5mol/L Tris-HCl,pH6.7 分离凝胶缓冲液1.5mol/L Tris-HCl,pH8.9 电极缓冲液系统0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸 ) pH8.3 样品缓冲液0.1mol/L Tris-HCl， pH 6.7, 40%甘油、 0.05mg/ml溴酚蓝PH 8.3PH 6.7PH 8.9PH 8.3（ 2）不连续电泳浓缩胶和分离胶的配方贮存液 凝胶终浓度 T 4% 7.5% 10% 15% 20% 单体贮液（ 14.55:0.55） 0.65 3.8 5.0 7.5 10浓缩胶缓冲液 (ml) 0.1 0 0 0 0分离胶缓冲液 (ml) 0 0.3 0.3 0.3 0.3dd H2O(ml) 4.25 10.9 9.7 7.2 4.7真空抽气10%AP(过硫酸铵 ) (ul) 5 15 15 15 15TEMED四甲基乙二胺 (ul) 2.5 7 7 7 7总体积 5ml 15ml2. 样品的准备v 样品缓冲液与浓缩胶缓冲液 pH相同。v 样品缓冲液中可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。v 样品缓冲液中通常加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。v 标准蛋白质样品：是一组（ 5 7种）已知分子量范围的、构型相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。3. 加样要求v加样量一般 10 20l。v用微量注射器距槽底三分之一处进样。注射器不可过低 ,以防刺破胶体 ,也不可过高 ,以免样品下沉时会发生扩散。v为避免边缘效应 ,最好选用中部的孔注样。v 浓缩胶制备完毕，不宜储存，应立即电泳。 v 对垂直板凝胶，电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当样品进入分离胶后改为 20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约 5mm时，停止电泳。4. 电泳荧光探针考马斯亮蓝氨 基 黑染色 银 染 色过碘酸 -Schiff试剂阿尔辛蓝 5. 检测三、 SD