酶免检测技术影响

酶免检测技术影响因素检验科检验科 马燕马燕n酶免技术的分类n实验注意事项n实验中常见问题及解决方法均相法 双抗原夹心法 （测抗体） 直接法 双抗体夹心法（测抗原）酶免法 间接法 测抗体、抗原 EIA 非均相法ELISA 竞相法 测抗体、抗原捕获法 测 IgM抗体enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定法 酶免技术的分类n 双抗体夹心法HBsAg、 HBeAgn 双抗原夹心法HBsAb夹心法n HBcAb、 HBeAb竞争法n HDV IgG/M、 HEV IgG/M测 IgG 测 IgM间接法n HAV-IgM捕获法测 IgM实验注意事项1、标本n 避免溶血n 尽量新鲜，避免细菌污染一般 5天内检测的血清可 4 保存，否则低温保存。2、试剂n 使用前平衡至室温n 配置洗液应使用去离子水或蒸馏水，保证水的新鲜3、设计实验n 设计好孔位，通常阴阳对照孔各 2孔、空白 1孔。必要时做好标注，避免错误4、加样n 样品应全部加于反应孔底部，避免液体悬挂在孔壁上。n 加样量准确！n 加下一标本时更换吸嘴5、加酶结合物n 一般使用滴瓶滴加n 滴加时应保持瓶身垂直、加液速度适中，使液滴大小均匀一致n 一步法时先加样本后加酶，不可颠倒顺序n 一般空白孔只加底物和终止液，而不能加入其它物质，尤其是酶结合物6、温育n 温度、时间要严格控制！n 最好使反应杯尽快升温到所需温度n 最好放入湿盒或水浴箱中n 反应板贴上即时贴微孔板放入水浴箱后，孔内温度上升到 37 需要一定时间。但实际工作中很少有人注意这个问题，通常是放入即计时，导致实际温育时间不够，弱阳性标本漏检。解决：微孔板放水面上或湿盒中纱布浸透水，使板底部直接与37 接触，迅速达到温度。7、洗板n 使用专用洗涤液n 一般洗涤 46次n 若手工洗涤，前两次洗涤应不溢出反应孔 污染后面几次洗涤应加满所有孔 干净n 每次加洗涤液后应浸泡 30秒再甩去洗液n 反应板倒扣吸水纸上拍干n 洗板时应注意非离子去垢剂的浓度。洗液中 Tween20高于 0.2%,可使包被子固相上的抗体抗原解吸附而影响测定下限。8、加底物n 底物 A液通常是 H2O2 还原剂n 底物 B液通常是 TMB（ 3、 3、 5、 5 -四甲基联苯胺） 氧化剂n TMB氧化后呈蓝色，被 2N H2SO4 终止后呈黄色，450nm波长处有最大吸收峰n 底物 B应避光保存，实验时加完底物 A、 B保温时也应避光保存。9、比色n 空白孔校零，读取各孔 OD值n 单波长 or双波长的选择：单波长通常是对显色具有最大吸收的 450nm或 492nm双波长酶标仪则在敏感波长 450nm和非敏感波长 630nm下各测定一次。使用双波长时不必设定空白孔，否则会造成孔吸光度数为负数。n 若底物为 OPD（邻苯二胺），波长为 492nm若底物为 TMB， 波长为 450nm10、结果判读不同试剂，CUTOFF值计算方法不同项 目 CUTOFF 阳性判断HBsAb HBeAg阴性 OD *2.1 cutHBeAb （阴性 OD+阳性 OD） *0.5 1:20 准确配置洗 涤 液10、试剂盒运输时间太长，受高温影响 夏天 长 途运 输时 ， 缩 短 时间 ，低温措施11、试剂盒失效 不适用失效 试剂现 象 可能原因 解决方法重复性差1、样品数量较多、加样时间过长重复 测 定 标 本 时 ，尽可能使用同一移液器，装 紧 吸嘴，条件、人 员应 尽量与上次保持一致，以排除 这 些因素造成的重复性差的可能性。2、加样量不一致3、孵育时间不一致4、洗涤条件不同5、操作人员不同满 板白，阳性对 照不 显色1、把终止液误当作酶结合物、或底物使用 严 格按 试剂说 明 书 操作，加液时 看准 标签 ，正确稀 释 洗 涤 液，不要漏加 试剂2、漏加试剂，如酶结合物、底物 A、 B液3、蒸馏水被污染，或盛洗涤液桶被污染，留有使酶失活的物质换 用合格水盛蒸 馏 水的瓶子要 洁净现 象 可能原因 解决方法满板显色1、底物失效、或被 污 染 更 换 底物2、加好底物后在保温 时 ，受 强 光或紫外 线 照射显 色 时 避光保温3、反 应时间过长 准确定 时4、水浴箱温度 过 高 调 准水浴箱温度5、加 酶 量 过 多， 50ul误 当 100ul.丙肝 酶 稀 释时 加量 过 多加液量、稀 释 要准确6、 该 批 样 品放置 时间过长 ， 样 品 污菌样 品 应 新 鲜 ， 长 期保存 应 -20，防止 污 染7、吸嘴重复使用，未洗干 净 而用于加酶 或底物吸嘴 应洁净8、洗 涤 不充分，反 应