遗传毒性评价

微核制片技术及其应用 (诱变剂的遗传毒性评价 ) 一、实验目的1. 了解微核检测的原理和毒理遗传学意义。2. 掌握蚕豆根尖微核（或细胞电泳）监测环境污染的一般方法。3. 学会利用微核测试系统评价环境物质的遗传毒理效应。二、实验原理（微核技术）1、微核（ micronuclei,MCN）： 是真核类生物细胞经辐射或化学药物的作用而产生的一种游离于主核之外的 异常核结构 。在 细胞间期 微核呈圆形或椭圆形，大小为主核 1/3以下 。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成 DNA的能力。微核形态2、微核的形成机理 ：许多 理化因素 ，如辐射、化学药剂等作用于分裂细胞， 引起染色体断裂或干扰染色体行为 使之在 有丝分裂过程中行动滞后 ，末期未能进入主核，当子细胞进入下一次分裂间期时，便浓缩形成独立于主核之外的小核 微核。3、 微核率的 大小与用药剂量或辐射累积效应呈正相关， 因此，可 在间期进行微核的观察和计数来检测染色体畸变水平， 指示染色体或纺锤体的损伤程度 微核是常用的遗传毒理学指标之一。4、 微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等方面微核成因化学致突变物化学致突变物染色体作用于纺锤丝无着 丝点，片或环整条染色体带着丝粒的环和断片于细胞分裂末期细胞质中形成微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成多染红细胞（多染红细胞（ PCE）呈灰蓝色，）呈灰蓝色，正染红细胞（正染红细胞（ NCE）呈橘黄色。）呈橘黄色。微核的形成70年代初， Matter和 Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用一定培养条件与时间下的骨髓和外周血细胞，但细胞同步化困难，微核率低，约 0.2%。如用高等植物花粉，利用其天然的同步性作微核测试材料，效果较好，其中 70年代末 Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草，建立的四分孢子期微核率计数（ MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自 1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试系统，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家 生物监测技术规范（水环境部分） 。美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，可以推广。三、实验用具1、材料：蚕豆（ Vicia faba, 2n=12）干种子蚕豆根尖细胞的染色体大、数量少， DNA含量高，根尖中含有较多的分裂相细胞，对诱变因子反应敏感，且容易观察，是理想的遗传毒理分析材料。显微镜、培养箱、紫外灯、水浴锅、剪刀（或刀片）、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、烧杯、滤纸等。2、实验仪器及用具1mol/L盐酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品红染液；NaN3（叠氮钠）、 EMS（甲基磺酸乙酯）、DES（硫酸二乙酯）等化学诱变剂等；紫外线、微波等物理诱变因子。3、药品和试剂1、浸种催芽 ： 25 下浸泡 24h，吸胀后，用河沙作发芽床，25 培养箱中催芽 12 24h，初生根长出 2 3mm时，取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中， 25 继续催芽，大部分根长至 12cm （约 3648h） 。2、染毒： 用被检测液处理根尖。每处理选 6 8粒初生根生长良好、根长一致的种子，放入培养皿中，用被检测液浸没根尖。阳性因子可采用 NaN3和紫外线等， 0.2、 0.4、 0.8mmol/L NaN3溶液。紫外线分别处理 20、 40、 60min。另外可取一处污水作被检液之一。用自来水（或蒸馏水）处理作对照。处理根尖 12 24h。3、根尖细胞恢复培养： 处理后的种子用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次 2 3min。洗净后置入辅有湿润滤纸的瓷盘中， 25下恢复培养 22 24h。四、实验操作流程4、根尖细胞固定并保存： 切取恢复后的 1cm长的幼根，甲醇：冰醋酸（ 3： 1）液固定 24h。 置 70%的乙醇中保存于 4 冰箱中。5、解离： 加入 1mol/L盐酸浸没幼根 10min，使幼根软化。解离前后用蒸馏水清洗干净。6、染色、压片： 截取 1 2mm长的根尖置载玻片上，滴一滴染液，染色 5 8min，加上盖玻片，压片。7、镜检观察、计数： 首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。每一处理观察 3个根尖，每个根尖数 1000个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为该处理的 MCN ，即微核千分率。五、结果与分析微核识别标准：（ 1）在主核大小的 1/3以下，并与主核分离的小核。直径大约是细胞直径的 1/20 1/5。（ 2）小核着色与主核相当或稍浅。（ 3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则形。处 理 观 察的 细 胞数微核数 总计 微核 NaN3 (mmol/L)0.20.40.8紫外 线 (min)204060蚕豆根尖微核检测记录表注：以小组为单位统计平均微核千分率。处 理 观 察的 细 胞数微核数 总计 微核 NaN3 (mmol/L)0.20.40.8蒸 馏 水计算各测试样品（包括对照）的微核千分率（ MCN ）：样品污染（中毒）程度的确定：MCN 10 ，基本没有污染（中毒） ；10MCN18 ，轻度污染（中毒） ；18 MCN 30 ，中度污染（中毒）；MCN 30 ，重度污染（中毒）。某样品或对照观察到的微核数某样品或对照观察到的细胞数MCN= 1000“污染指数 ”判别（此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN 本底的波动）：样品实测微核平均千分率对照平均微核千分率0 PI 1.5，基本没有污染；1.5 PI 2，轻度污染；2 PI