真菌感染与实验室诊断进展医学

全国基层医疗机构 抗菌药物合理应用 1 常见病原真菌 李若瑜 北京大学第一医院 北京大学真菌和真菌病研究中心 2 真菌感染的分类 根据真菌侵犯人体的部位分为 四类 ： 浅表 真菌病 皮肤 真菌病 皮下 组织真菌病 系统 性真菌病 浅部真菌病 深部真菌病 3 临床常见的真菌病 浅表真菌病 ： 花斑癣 掌黑癣 毛结节菌病 皮肤真菌病 ： 皮肤癣菌病 手足、体股、头、甲 皮肤念珠菌病 皮下真菌病 ： 孢子丝菌病 着色芽生菌病 暗色丝孢霉病 足菌肿 系统性真菌病 ： 念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 接合菌病 双相真菌感染 4 浅部真菌病 限于皮肤最外层，甲板、毛发和粘膜 的感染。 主要的感染是皮肤癣菌病和浅表念珠 菌病。 大多轻微，容易诊断，对治疗反应良 好。 5 手、足、甲癣 最常见的真菌病 6 各种头癣：传染、危害健康 7 皮下真菌病 往往经过外伤发病 孢子丝菌病孢子丝菌病 着色芽生菌病着色芽生菌病 8 系统性真菌病 常起源于肺，可以播散到全身许多器官 。 常通过吸入致病菌孢子而获得，其致病 菌腐生于土壤或腐败有机物中，或作为 植物致病菌。 病原体可分为两组： 真正的致病菌和条 件致病菌。 9 系统性真菌病 危及生命 10 系统性真菌病主要的致病真菌 荚膜组织胞浆菌 粗球孢子菌 皮炎芽生菌 巴西副球孢子菌 11 临床常见的条件性真菌感染 念珠菌病 : 最常见， 血源感染的第 4位。 曲霉菌病 : 常见于干细胞移植、实体 器官 移植、大剂量化疗患者。 隐球菌病 : 艾滋病人患病率为 10-20%。 接合菌病（毛霉病） :多见于重症糖尿病 、烧伤病及器官移植病人。 12 临床有增多趋势的条件性真菌 非白念念珠菌感染 毛孢子菌感染 地霉感染 镰刀菌感染 枝顶孢霉感染 暗色真菌感染 马尔尼菲青霉 13 真菌感染的诊断方法 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学 14 真菌感染的实验诊断方法及问题真菌感染的实验诊断方法及问题 显微镜检查 -阳性率？ 培养 -时间？敏感性？意义 ？ 血清学 -敏感性？特异性？ 分子生物学 -标准化？ 15 组织病理学 16 阿申蓝染色阿申蓝染色 H39:199-205 侵袭性真菌感染中葡聚糖检测 AML, MDS Receiving antifungal prophylaxis 102 Cut off 60 pg/ml Clin Infect Dis 2004;39:199-205. 30 30with candidemia control subjects 侵袭性真菌感染的葡聚糖检测 Fungitell assay 103 检测曲霉半乳甘露聚糖抗原的 EIA 方法（ Platelia） 检测位于曲霉细胞壁上的 galactomannan,（ GM） 3. Detection avidin-enzyme + substrate 2. Detecting Ab anti-galactomannan biotin conjugated Ag blood, urine, BAL 1. Capture antibody monoclonal anti - galactomannan Specificity = 90% sensitivity = 75% 104 Platelia Aspergillus EIA 结果判断 105 曲霉的 GM 抗原检测 乳胶凝集试验（ Pastorex） (15ng/ml) 酶连免疫吸附试验（ Platelia） (1ng/ml) 灵敏度（ %） 特异度（ %） LA 25-70 90-100 ELISA 50-90 80-90 Sabetta et al. JID 1985; 152: 946 Ansorg et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 582 Verweij et al. JCM 1995; 33: 3150 Maertens et al. Blood 2001; 97: 1604 Herbrecht et al. J Clin Oncol 2002; 20: 1898 106 GM 抗原抗原 107 GM抗原检测用于侵袭性曲霉病诊断 与临床诊断和疗效反应有良好的一致性。 检测方法有 ELISA、 放射免疫分析（ RIA） 和乳胶凝集试验等。 Platelia试剂盒采用 ELISA方法，敏感性 80% ，特异性 80%。儿童假阳性 10%。 Cut-off值影响结果 0.5: 早期诊断 ,特异 性差 ;1.5:特异性提高。可动态观察。 Dr.Maschmeyer G. in 2nd Trends in Medical Mycology, 23-26 October 2005, Berlin 108 曲霉感染检测的影响因素 半乳甘露聚糖在 血中存在时间短 ，建议： 高危人群每周至 少检测 2次，动态观 察 结合影象学、培 养结果综合分析诊 断 假阴性 假阳性 哌拉西林 /他唑巴坦 与其它细菌或真菌成分有交叉反应 肠道中定植的曲霉释放 GM进入血 液循环 含有谷物的食物中存在 GM抗原， 通过受损肠黏膜进入血循环导致 抗 原血症，化疗后出现严重黏膜炎的 更易发生 109 检测真菌检测真菌 DNA的的 PCR试验试验 标本： 全血 血清 活检组织 BAL CSF 不同方法： DNA 提取 PCR 设计 产物检测 110 PCR PCR技术用于诊断 种特异种特异 -PCR 非特异非特异 PCR 杂交杂交 Standart “single“ “nested“ PCR-EIA “Real-time“ 标本标本 全血全血 血浆血浆 血清血清 BAL 最低检测范围最低检测范围 4-10 cfu/ml 25-100 fg DNA 原位杂交原位杂交 目的基因目的基因 多拷贝基因多拷贝基因 111 PCR过筛试验诊断 IA 每周监测 2次 通用引物 ; 确定采用巢式和实时定量 ; 敏感性 100%,特异性 65%; 早于临床症状 2天 ,早于确诊 9天 ; 动态观察持续阴性可排除 ; Dr.Maschmeyer G. in 2nd Trends in Medical Mycology, 23-26 October 2005, Berlin, Germany. 112 Jun Zhao et al. JCM 2001 Nested PCR in Animal Models 余进，等。中华检验医学杂志， 2003 种特异引物巢 式 PCR扩增烟曲霉 rRNA基因 113 动物模型中巢式 PCR方法检测的灵敏度 动 物模型 （只数） 巢式 PCR阳性 结 果 （百分比） 血培养阳性 结 果 （百分比） 侵 袭 性肺烟曲霉感 染小鼠（ 29） 23（ 79.3%） 2（ 6.9%） 烟曲霉血症小鼠（ 25） 19（ 76%） 7（ 28%） 总计 （ 54） 42（ 77.8%） 9（ 16.7%） 灵敏度灵敏度 =77.8% 余进，等。中华检验医学杂志， 2003 114 突破方向 对 基因组序列和功能的了解，找出特异处 改进目前方法，提高敏感性 Real-time PCR 多重 PCR 芯片技术 其它特异抗原 115 DNA 微阵列 芯片、探针 : Candida spp. Aspergillus spp. 临床标本 : 10-20 cfu/ml body fluid PCR electrophoresis: 75.6% DNA microarray: 87.9% Zhu et al. AAA. San Francisco, 9-12th September 2004 116 真菌非培养诊断小结 在诊断侵袭性真菌感染有一定价值，尤其 早期诊断和疗效监测 理想的检测方法很少 隐球菌乳胶凝集 曲霉 ELISA Glucan PCR方法有待验证 多次取材重要 结合临床表现、真菌学等传统方法和影象 学 117 122 patients 323 samples 33 proven cases 肺曲霉病诊断时间表 CT positive 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 chest X-ray antigen -gluca