流式细胞术在白血病诊断中的应用ppt课件

流式细胞术在白血病诊断中的应 用 一 简介 FCM：集激光、电子、光电测量、计算机、荧 光化学、单抗的高科技仪器。 对处在快速 直线流动状态 中的 单个细胞 或 生物 颗粒 进行 多参数的 、 定量分析 和 分选 的技术。 分两类：台式机（临床型） 大型机（ cell sorting).科研用。 BD FACSVantage SE FCM的结构 FCM的结构 细胞流动室； 光源； 聚光系统； 信号检测器； 电子计算机； 细胞分选装置。 光源 细 胞 流 动 室 聚光系统 信号监测器 数据的存储、显示与分析 数据的存储： listmode 显示： 单参数直方图 (histgram); ：常用于分析 DNA等； 双参数：二维点图等（ dot plot) ； 等高图： (contour) 三维等高图： 3D plot 设门（ gating): Data Acquisition - Listmode 一定条件下，荧 光强度与细胞内 DNA含量成正比 。 只反应一个参数 与细胞数量间的 关系，不能显示 两个独立参数与 细胞的关系。 Immunofluorescence Flow Cytometry cont. Data displayed Green Fluorescence Intensity Number of Cells Unstained cells FITC-labeled cells One Parameter Histogram Red Fluorescence Intensity Green Fluorescence Intensity Two Parameter Histogram Contour plot 3D plot:细胞多 的地方，山峰高 。 FCM检测常用参数 内部参数 散射光测定 前向角散射 (forward scatter FSC):与激光束平行的 信号。与 被测细胞大小有关 。 侧向角散射（ side scatter SSC):与激光束呈 90的 光信号。与 细胞内结构和颗粒物质多少有关。 采用 FSC、 SSC组合，可区分淋巴细胞、单核细胞 、粒细胞等群体。 FCM常用参数 外部参数 荧光测量 荧光素探针标记的细胞所发荧光。 荧光信号强弱、多少与细胞的抗原量、内含物多 少有关。 常用的荧光显色剂： FITC： PE： 藻红蛋白 PerCP； PI： 碘化丙啶，测定 DNA含量。 临床常用三色荧光检测，现有四色分析 。 CD45 vs SSC设门 CD45为造 血细胞（ 红系除外 ）的共同 抗原。避 免杂质细 胞的沾染 。 CD45: 淋巴细胞 单核细胞 成熟粒细胞 原幼细胞 在 FCM分析时特别注意： 细胞的分化成熟、细胞内部结构及其分化抗原的 逐渐增减是渐进过程，非突变。故同时获知一个 细胞的多种参数方能正确判断细胞属性。 当细胞发生克隆增殖后，可出现抗原量变、丢失 和错译表达。 细胞抗原的阳性率及荧光强度是同等重要的指标 。 FCM可采用的标本 单个细胞，新鲜标本，抗凝保存： PB； BM；（ 有时 BM活检标本） LN（ 包括 FNA）； CSF； 组织浸润 FNA 或活检标本； 急性白血病 FCM分析 白血病细胞的抗原表达一定程度遵循正常细胞抗 原表达的规律。 白血病细胞为肿瘤性生长，可出现正常细胞表达 以外的异常现象，如缺失、错译表达等。 目前未发现白血病特异性抗原，须多参数分析。 临床原 /幼细胞群定性比定量更为重要。 抗体的选择： 1. 常用抗体选择： 核心 McAbs:确定淋系或髓系（系特异性） 髓系： CD33、 CD13、 CD14， cMPO B-cell: CD19、 CD10、 cCD22 CD20 T-cell:CD7、 CD2、 CD5、 cCD3 红系： GlyA 巨核细胞： CD41、 CD61 非系列特异性： CD34、 DR、 CD45 AL panel CD7/CD117/CD45-protocal HLA-DR/CD13/CD45 CD14/CD2/CD45 CD19/CD5/CD45 CD33/CD34/CD45 CD20/CD10/CD45 CD64, 117,13,33,14,64myeloid 19,10,20B lineage 7,2,5T lineage DR,34 immature AML常见 CD表达 FAB Subtype Common Phenotype Comments/Variations M0 DR.CD13,CD33,CD34,CD7, cMPO* Generally negative for lymphoid markers M1 Similar to M0 except CD15 M2 DR,CD13,CD33,more CD15,lessCD34 CD19(+) -t(8;21) favorable prognosis M3 DR(-)*,CD13,CD15,CD33,CD34-/+, CD2(+),DR(-) in maturing AML,consider M3.Myeloid/naturalkiller cell ALCD56(+). M4/M5 DR,CD15,CD14,CD33,CD13,CD4weak CD2(+),consider M4Eo M6 DR,CD13-/+,CD33+/-,CD34,CD45 weak Mature forms express glycophorin M7 DR-/+,CD33+/-,CD34,CD41,CD61 Beware of platelet.adhesion 正常骨髓的 FCM二维点图 Diagnosis: AML- M1 Antigen Profile: positive : DR, CD13, CD34, CD38; partially positive for CD7,negative cCD3. Diagnosis: Acute myeloid leukemia with differentiation (AML M2) with features consistent with t(8;21) Antigen Profile: Positive for CD33(dim), CD34, CD13, CD15 CD11b (partial) with CD19. Negative for CD56,CD10,CD2 72 , female . A bone marrow examination was performed. Diagnosis: AML- M5 Antigen Profile: Positive for CD33, CD38,CD34,HLADR, CD4(dim), CD64, CD13,CD14, CD11b and CD15. Diagnosis: Erythroleukemia (FAB M6) Antigen Profile: Blasts positive for CD33, CD71, CD34, CD38, CD13; Diagnosis: Acute megakaryoblastic leukemia (FAB M7) Antigen Profile: Positive for CD33, CD71, CD34, CD61 ALL常见 CD表达 Subtype Common Phenotype Comments/Variat ions B-precursor ALL DR, CD19, CD20-/+, CD10+/-, CD34, TdT,sIg(-) Infants CD10(-) Multile myeloid Agt(9;22) Pre-B ALL DR,CD19,CD20+/-,CD10, CD34(-),cIgM(+),TdT+/- t(1;19)-CD34(-)poor prognosis. B-ALL DR,CD19,CD20,CD22,CD24, CD10+/-,CD34(-),SIg L3 T-ALL cCD3,CD5,CD7,CD1,CD2,dual CD4/8,CD10+/-CD34-/+ Frequently lose T- cell Ag. 6y. Girl, Hb: 100g/L WBC:10X10G/ L,LC80% Plt. 85X10G/L Diagnosis: ALL, B- precursor type (common ALL) Antigen Profile: Positive for CD71, CD19, CD10, CD22, HLADR, CD34; dimly positive for CD33 A 15 year old girl who played for her high school soccer team noted to have difficulty breathing during her workouts. A chest x-ray revealed a large mediastinal mass, and she was found to have anemia and an elevated white blood count Diagnosis: ALL, T-cell Antigen Profile: Positive for CD7, CD5, CD3, CD34, CD10; partly positive for CD4 and CD8 Diagnosis: B -Precursor ALL (common ALL) Antigen profile: Positive for CD19, CD10, CD34, HLADR; negative for CD20, CD45, smIg 未分化和双标白血病 AUL： 仅占 1% 典型的 AUL： DR+， CD34+ with no lineage-specific antigens. Biphenotypic leukemia(mixed):仅有 7% 能严格符合此型。过度诊 断是由于： 未排除非白血病细胞； 非特异性结合； 某些抗体缺乏系特异性； 特异性抗原为： BcCD22; TCD3; MMPO; Scoring syetem for the definition of biphenotypic AL Points B-淋巴 T-淋巴 髓系 2 cCD79a cCD3 cMPO CD22 TCRab cIgM TCRrd 1 CD19 CD2 CD117 CD10 CD5 CD13 CD20 CD8 CD33 0.5 TdT TdT CD14 CD7 Diagnosis: Acute mixed lineage leukemia with t(4;11) Antigen Profile: One population CD19+CD22+DR+CD20-CD10-; another CD33+DR+CD64+CD14+ B-LPD常见 CD表达 Disorder Common Phenotype Comments/Variations CLL DR,CD19,CD20,CD5, CD22(-), CD23,CD10(-).clonal SIgM,FMC7(-) CD20 dim PLL DR,CD19,CD20.CD5(-),CD22, CD23( -),CD10(-),bright clonal SIg CD20 bright。 CLL/PLL(30%幼淋细胞 ) MCL DR, CD19,CD20, CD5, CD22, CD23( -),CD10(-)FMC7(+) SIg bright Cyclin D1 overexpressed FCC lymphoma DR,CD19,CD20,CD5(-),CD22, C23+/ -,CD10 CD10 negative20% HCL DR,CD19,CD20,CD5(-),CD22,CD23(- ),CD10(-),CD11c,CD25,CD103 SIgD common,very bright CD22 and CD11c Plasma cell dyscrasias DR(-),CD19(-),CD20(-),CD22(- ),CD38,CD45,clonal cIg, Bright CD38,dim CD45 73 , woman,mild splenomegaly ,WBC normal,with slight relative lymphocytosis, a PB specimen was sent for flow cytometry Diagnosis: Chronic lymphocytic leukemia Antigen Profile: Positive for CD19, CD22, CD5, kappa, CD23, dimly positive for CD20; MCL Ag profile: positive for CD19,CD5,lambda(bright),CD20 （ bright),FMC7.negative for CD10, CD23, CD11c. CD103. CD3. Diagnosis: C