真菌学概述ppt课件

临床真菌学 真菌学概述 Hi Bud! Hi pal! Huh. You guys get all the attention From Donnelly JP The main players 真菌 (fungus)是 一种真核细胞型微生物，一类具有典型细胞核 ，有核膜和核仁，胞质内有完整的细胞器，无根、茎、叶，不 含叶绿素，无光合色素，细胞壁含几丁质和纤维素的单细胞或 多细胞异养真核细胞型微生物。 真菌广泛分布于自然界，种类繁多，有 10余万种。大多对人无 害，有的甚至有益，如食用蕈类，有的真菌用于生产抗生素和 酿酒等。然而有些真菌也是造成动植物病害的病原菌之一，其 中与医学有关的真大约有数百种，少数真菌可以引起人类感染 性、中毒性及变态反应性疾病（如曲霉菌属、毛癣菌属）。 近年来，由于抗菌药物的广泛应用和或应用激素、抗癌药物导 致机体免疫低下等原因，而使机会致病真菌感染明显增多（如 曲霉菌、组织胞浆菌、卡氏肺胞菌、马尔尼菲青霉菌）。 真菌 细菌 细胞 真核细胞 原核细胞 细胞核 有，还有核仁、核膜 拟核，无核仁 、核膜细胞器 有 只有核糖体 细胞壁 无肽聚糖，由多糖（ 75% ） 与蛋白质（ 25% ） 有肽聚糖 对青霉素或头 孢菌素敏感 不敏感 敏感 细胞膜 含固醇 不含固醇 大小，复杂程 度 比细菌大几倍至几十倍 ，结构复杂 小，简单 第一节 分类 真菌属真菌界，真菌属真核细胞型微生 物。 真菌的营养方式是吸收，植物的营养方 式是光合作用。 真菌分类的 主要依据 为：有性生殖的各 种器官、 无性菌丝、孢子 及菌落的形态 特征。 真菌分类 粘菌 门 鞭毛 菌亚 门 真菌界 接合菌亚 门 * 真菌 门 子囊菌亚 门 * 担子菌亚 门 * 半知菌亚 门 * 根据卡氏肺囊虫囊虫壁的超微结构类似真 菌细胞，将其称为卡氏肺 胞菌 接合菌门 子囊菌门 担子菌门 壶菌门 真菌分类 接合菌亚门 分为 2纲 7目 24科 115属， 600余种。 属条件致病菌，绝大多数为无隔、多核菌丝体 ，如毛霉菌、根霉菌等。 子囊菌亚门： 6纲 1959属， 15000余种。 主要特征 :有性生殖 产生子囊和子囊孢子 包括：青霉、曲霉、小孢子菌属、毛癣菌属、 组织胞浆菌等有性期、毛癣菌属、酵母菌属 等 。 真菌分类 担子菌亚门 具有担子和担孢子，如食用菌蘑菇、灵芝以 及致病性真菌新生隐球菌。 半知菌亚门 3纲 1825个属，约 15000种。 包括：酵母、隐球菌属、 念珠菌属 、红酵 母 属、丝 孢酵母属、皮肤癣菌、青霉、 曲霉 及部分双相 真菌等。 第二节 真菌的基本特性 单细胞真菌 圆形或卵圆形 酵母菌 (yeast) 多细胞真菌 菌丝 和孢子 丝状菌 (filamentous fungus) 交织成团 或霉菌 (mold) 二 相性 (dimorphic) 一、形态与结构 单细胞真菌形态 呈圆形或卵圆 形，常见于酵 母菌或类酵母 菌，对人致病 的主要有新生 隐球菌和白假 丝酵母菌。这 类真菌以出芽 方式繁殖，芽 生孢子成熟后 脱落成独立个 体。 多细胞真菌形态 多细胞丝状真菌能长出菌丝，菌 丝延伸分枝，有 的菌丝上长出孢 子。各种丝状菌 长出的 菌丝和孢 子 形态不同，是 鉴别真菌的重要 标志。 1.菌丝 hypha 有隔菌丝 多数致病性真菌 无隔菌丝 在环境适宜情况下由孢子长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝 菌丝形态 (螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状、梳状等 )有助于鉴别 营养菌丝 气生菌丝 生殖菌丝 按生物 学功能 有性孢子 :同一菌体或不同菌体上的 2个细胞融合经减数分裂形成 无性孢子 :菌丝上的细胞分化或出芽生成 病原性真菌大多形成无性孢子病原性真菌大多形成无性孢子 分生孢子 叶状孢子 孢子囊 孢子 大分生 孢子 大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依 据 小分生孢子 真菌都能产生 芽生 孢子 假菌丝 厚 膜 孢子 关节 孢子 多细胞真菌 形态形态 spore hypha 大分生孢子 芽生孢子 假菌丝 厚膜孢子 关节孢子 孢子囊孢子 真菌孢子和细菌芽胞的区别 真菌繁殖结构 真菌孢子 细菌芽胞 抵抗力 不强，加热 60-70 短时间 即可死亡 强，有的可耐 100 数小时 数目 一条菌丝可产生多个孢子 一个菌体只形成 一个芽胞 作用 为繁殖方式之一 不是繁殖方式 形状 形状多种多样 圆形或椭圆形 二、真菌的培养特性 特点：低营养、低 PH(4.0-6.0)、高湿度和氧、温度（浅 部感染真菌 22-28 ，深部感染真菌 37 ）。 培养基：沙保 (Sabouraud)培养基（常加氯霉素和放线菌 酮） 菌落：单细胞 -酵母 型菌落、 类酵母 型菌落（假菌丝） 多细胞 -丝状 菌落 菌落形态也是鉴别真菌的重要依据 酵母型菌落 是单细胞真菌 的菌落形式，菌落光 滑湿润，柔软而致密 。形态与一般细菌菌 落相似，如隐球菌即 属之。有部分单细胞 真菌在出芽繁殖后， 芽管延长不与母细胞 脱离，形成假菌丝。 假菌丝由菌落向下生 长，伸入培养基中， 这种菌落称为类酵母 菌落，如假丝酵母菌 。 C. albicans菌落 (类酵母 型 ) 真菌在出芽繁殖后， 芽管延长不与母细胞 脱离，形成假菌丝。 假菌丝由菌落向下生 长，伸入培养基中， 这种菌落称为类酵母 菌落。 2.霉菌型菌落（丝状菌落） 是多细胞真菌的菌落形式，由许多管状分 支的菌丝体构成。 菌落成棉絮状、绒毛状或粉末状，菌落正 背两面呈现不同的颜色。菌落的形态、结 构和颜色常作为鉴定真菌的参考。 真菌有从中心向四周等距离生长形成圆形 菌落的倾向，所以临床体癣、股癣、叠瓦 癣等皮损表现为环形或多环形。 曲霉属 霉菌型菌落 青霉菌落 霉菌型菌落 双相真菌 凡在组织内和在特殊培养基上 37 培养时呈酵母相 ，而在普通培养基上和室温培养时呈菌丝相的一类 真菌，统称为双相真菌（ dimorphic fungi）。酵母 相也称为组织相，是主要的 致病相。 临床上重要的传统双相真菌包括：孢子丝菌、粗球 孢子菌、 组织胞浆菌、 皮炎芽生菌、副球孢子菌等 。近年发现的 马尔尼菲青 霉 等。 近年来，有学者将双相真菌的概念扩大，认为凡是 具有两种表型的真菌均称为双相真菌。如白念珠菌 ，在 YPD培养基上，表现为酵母相；而在 Lee培养基 上则呈菌丝相。 双相真菌 特 征 菌丝 相和酵母相能相互转化，这种转化与培养温度 、培养基成分、二氧化碳和氧的浓度变化有关。 双相真菌既能引起皮肤感染又能引起内脏器官的 感 染。 鉴 定 双相真菌的鉴定主要依赖于转化试验。 真菌的繁殖 方式 有性繁殖 无性繁殖 出芽繁殖：为酵母菌的主要繁殖方式。 分裂繁殖：以二分裂法进行繁殖，可见于某些双 相真菌在体内的繁殖。 芽管繁殖：真菌孢子萌发芽管，芽管延长后形成 菌丝。 生隔繁殖：分生孢子在分生孢子梗某一段落形成 一横隔，原生质浓缩后形成一个新的孢子，该孢 子又可再独立进行繁殖。 致病性 病原性真菌感染：主要为外源性真菌感 染。 条件致病性真菌感染：主要为内源性真 菌感染。 真菌变态反应性疾病 真菌性中毒 真菌与肿瘤 抵抗力 对干燥、日光、紫外线及一般消毒剂抵抗力 强 对热敏感， 601 小时菌丝、孢子均被杀死 对细菌抗生素不敏感 对二性霉素 B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑 、氟康唑和伊曲康唑敏感 临床标本的采集及检验程序 浅部感染真菌的检查可用 70%乙醇棉球擦拭局部后取皮屑 、毛发、指（趾）甲屑等标本。深部感染真菌的检查可 根据病情取痰、血液、脑脊液等标本。 标本类型： 皮肤的角质性物质：皮屑、毛发、指（趾）甲屑等。 分泌物和排泄物：痰、生殖道分泌物、尿液等。 血液和体液：血液、脑脊液、胸水、腹水、淋巴穿刺液 、脓液及渗出液等。 注意事项：若为浅部真菌感染，应刮片取病变部位边缘 的痂鳞屑。余同细菌感染标本采集事项。 真菌检验 各种真菌的形态结构有其一定的 特殊性，一般可以通过直接镜检 和培养进行鉴定，但具体方法应 根据标本种类和检查目的而异。 一、标本的直接检查 显微镜检查 抗原检测 显微镜检查 皮屑、毛发、指（趾）甲屑等标本置玻片上，滴加 10%KOH少 许，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加温，使被检组织中的角 质软化。轻压盖玻片，使标本变薄透明，然后在低倍或高倍 镜下检查。若见菌丝或孢子，即可初步诊断患有真菌癣，但 一般不能确定其 菌种。 皮肤 癣标本检查常用湿标本，不加染色。假丝酵母菌感染则 取材涂片，行革兰染色 ;隐球菌感染取脑脊液离心。沉淀物用 墨汁作负染色后 镜检。 结果的判断： 直接检查阳性有意义，阴性不能排除感染。 但阴道、痰等分离出假丝酵母菌、曲霉等条件致病菌需多次 阳性才有意义。 组织中发现分隔分枝的菌丝多为曲霉 ;粗大 、不分隔或不分枝的菌丝多为毛霉。假丝酵母菌出现假菌丝 代表活动性，有意义。 皮肤癣菌菌丝肥大粗长，提示处于 活跃状态。 酵母型和二相型真菌在组织内常表现为孢子。 10 10%KOH 压片：浅部真菌感染，敏感性更高 抗原检测 近年来 有许多方法用于检测深部感染真菌的抗体，作辅助诊 断荚膜组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。但系统性感染患者常 因免疫功能降低不出现抗体；而且许多真菌间抗原性有交叉 反应；有的产生抗体后维持时间较长，正常人群中有一定比 例的阳性率，则必须结合临床情况分析结果才能作出恰当的 诊断。 由于上述检测抗体受到许多因素的限制，及深部真菌感染时 ，早期培养阳性率甚低，晚期则多于失去治疗时机，因此用 免疫学方法从血清或其他部位检测真菌抗原，对早期诊断具 有重要意义。如乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多 糖抗原， ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及 免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原等，均为早期 ，快速、特异的诊断方法。 血清学试验 （ 1）测抗原 胞壁 1,3-D- 葡聚糖（ G试验），表面 抗原甘露聚糖（ LA试验），热不稳定蛋白（ LA试验 ），胞浆蛋白烯醇化酶（ ELISA和 WB）， Mr 65000 蛋白（抑制 ELISA）等。 （ 2）测抗体 烯醇化酶（ P47）抗体（ ELISA），白念 珠菌芽管抗体（ CAGTA）间接免疫荧光法。 （ 3） GM试验 临床意义：早期诊断侵袭性曲霉菌感染 检测物质：半乳甘露聚糖（ Galactomannan） 试验原理：双抗夹心法酶联吸附试验 标本：血清、肺泡灌洗液、脑脊液 二、分离培养 直接镜检不能确诊时应作真菌培养。 皮肤、毛发、甲屑标本经 70%乙醇或 2%石炭酸浸泡 2 3min杀死杂菌，无菌盐水洗净后接种于含放线菌酮和氯 霉素的沙保培养基上， 25 28 数日至数周，观察菌落 特征。必要时做小培养，于镜下观察菌丝、孢子特征进 行鉴定。 阴道、口腔粘膜材料可用棉拭子直接在血平板上分离。 若为血液需先增菌，脑脊液则取沉淀物接种于血平板上 37 培养。 若疑为假丝酵母菌取菌落研种于 0.5ml血清试管内， 371h 后涂片革兰染色。见有假丝酵母菌细胞长出芽管 即可初步鉴定为假丝酵母珠菌。 培养基的选择 1、葡萄糖蛋白胨琼脂 :也叫 Sabourand (沙保罗或 沙氏 )琼脂。它适合于多种霉菌的生长。 2、血琼脂培养基：适合于假丝酵母菌 3、 DTM：含蛋白胨、葡萄糖、酚红、放线菌酮、庆 大霉素、四环素等。它用于分离皮肤真菌。 4、左旋多巴 -枸橼酸铁 =咖啡酸培养基：用于新生 隐球菌的分离。 5、酵母浸膏磷酸盐琼脂：分离荚膜组织胞浆菌和 皮炎芽和菌。 二、分离培养 培养方法 :玻片培养法 (小培养 );平 皿 培养法 ;大试管培养法 二、分离培养 v培养温度： 25 28 和 35 37 菌落直接观察 观察菌落的生长情况是鉴别真菌的主要 方法之一。观察菌落时注意 菌落性质 菌落大小 菌落颜色 菌落是否下沉 ，是否使培养基开裂。 菌落涂片观察：丝状菌菌落用乳酸酚棉 兰染色镜检。 1.在玻片滴上棉兰 2.制作胶带粘菌小旗 3. 胶带黏面轻压菌苔粘菌 4.在胶带与棉棒交接处滴数滴 75%酒精 丝状真菌鉴定重要步骤 乳酸酚棉兰压片 5.翻转棉棒有菌面贴在拨片 33 6.胶膜上再滴棉兰 7.再加上盖玻片 丝状真菌鉴定重要步骤 乳酸酚棉兰压片 8.用手压实盖玻片 34 三、 生化试验 糖 发酵试验： 利用真菌对各种糖的分解能力及代谢产 物不同，借以鉴别。试验方法同细菌试验，主要用于 检验深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。常用的 有单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖），双糖（麦芽糖、 蔗糖、乳糖、海藻糖），三糖（蜜三糖），多糖（淀 粉）；醇类有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇 等。 同化碳源试验： 将 1ml含菌生理盐水与已融化的固体同 化碳源培养基（ 45 ）混合，然后在培养基上分别加 入各种糖少许，置 25 或 37 孵育后观察结果。若 24h 后无变化可重复加糖少许。如能同化，在加入糖的周 围有生长圈，否则无生长。固体平板培养基适用于生 长快的真菌，而液体培养基则适合于生长慢的真菌。 三、 生化试验 同化氮源试验或利用硝酸甲试 ： 方法同同化碳源试验，但需无氮 源的培养基，不加糖，加入硝酸甲。 其它： 另外还有牛乳分解试验和脲 酶试验、明胶液化试验等，操作方法 同细菌鉴定 。 四、动物试验 主要用于分离、鉴定致病菌。常用实验动 物有小鼠、豚鼠和家兔等。应按实验要求 ，选用一定的体重和年龄，具有高度易感 性的健康动物。接种途径有皮内、皮下、 腹腔、肌肉、静脉、脑内和灌胃等。 接种后应仔细观察动物的食量、精神状态 和局部变化，有时尚要测定体重、体温和 血液等指标。若死亡应立即解剖，检查病 变，或进一步作分离培养，证实由何病菌 所致。 五、核酸检测 （一） DNA中 G+C mol%含量测定 （二）电泳核型（ EK）分析 （三）随机扩增多态性 DNA（ RAPD） 分析 （一） DNA中 G+C mol%含量测定 是最早用于真菌分类学研究的分子生物学技术 。目前在酵母菌的应用较为成功。即利用真菌 DNA中核酸序列的同源性及基因大小相似性的 遗传特征，测定 DNA中的碱基含量（ G+C mol%含量）作为真菌分类鉴定的重要遗传指 标之一。因为每种真菌都有固定的 G+C mol% 范围且较为稳定，不同生物种的 G+C 含量是不 同的，生物种之间的亲缘关系越远，其 G+C 含 量差别就越大，反之亦然，因而可作为真菌的 分类学指标。 （二）电泳核型（ EK）分析 电泳核型是指细胞中的染色体在一定电场作用 下在固体包埋物中的排列情况，反映了染色体的 大小、数目和形状的差异。它是通过脉冲电场凝 胶电泳（ PFGE）完成的，能分辨 50 kb至 10 Mb 范围内的 DNA分子，基本满足酵母菌和丝状真菌 的要求。对病原体而言， EK分析特别适用于低 等真核微生物或原虫，它无需用 RE消化和探针 杂交，就可方便地从 EK的差异区别不同的菌种 。 EK分析带型清晰易辨、分辨力较强，电泳条 件稳定时结果重复性好。但 EK受电泳条件影响 较大，影响不同实验室间的可比性，而且相同大 小两条不同染色体往往因迁移率相近呈现为同一 条带，影响分辨力。此外它需要昂贵的仪器， DNA的制备及 PFGE过程也均较费时。 （三）随机扩增多态性 DNA分析 （ RAPD） RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡 核苷酸引物通过 PCR反应扩增靶细胞 DNA ，扩增产物经凝胶电泳，分