非无菌产品微生物检查控制菌检查法ppt课件

非无菌产品微生物检查：控制菌检查法 概述 控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物 。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按 规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法， 但必须证明替代方 法等效于药典规定的检查方法。 概述 微生物限度检查法中的控制菌检查在药典一、二、三部附录中内容基本一致 参照 ICH协调案 ” 非无菌药品微生物限度检查：控制菌检查 ” 进行修订。 主要修订内容 控制菌检查项目、培养基体系、 培养基适用性检查、 检查方法适用性试验、 结果判断等。 供试液制备及实验环境要求 -同 非无菌产品微生物检查：微生物计数法 。 -如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。 -中和剂或灭活剂的使用 使用了中和剂或灭活剂应确认有效性及对微生物的无毒 性并应确认供试液 与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。 控制菌检查法 增修订内容 收载方式 检验项目 替代法的应用原则 结果判断方式 修 订 前 微生物限度 检查 修 订 后 非无菌 产 品微生物 检查 ：微生物 计 数法 非无菌 产 品微生物 检查 ：控制菌 检查 法 非无菌 药 品微生物限度 标 准 收载方式 修 订 前 大 肠 杆菌、 大 肠 菌群、 沙 门 菌、 铜绿 假 单 胞菌、 金黄色葡萄球菌 梭菌、 白色念珠菌 修 订 后 大肠杆菌、 耐胆盐革兰阴性菌、 沙门菌、 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌、 梭菌、 白色念珠菌 检验项目 替代法的应用原则 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法 等效于药典规定的检查方法。 修 订 前 增菌、分离 (纯 化 )、生化 试验 适宜的 鉴 定 试验 。 修 订 后 增菌、分离 (纯 化 )、生化 试验 其它适宜方法 进 一步 鉴 定。 收载方式及 结果判断方式 修订内容 控制菌检查用培养基数量减少 7个；在增菌过程，使用无选择性增菌培养 基培养 理由 污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损伤，使用无选择性增 菌培养基培养，使受损伤的细菌得到修复，提高检出率。 培养基适用性试验 培养基是绝大多数微生物试验的基础其质量是微生物试验成功关键因素。 适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保 证。 培养基适用性试验 培养基的配制 可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培 养基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质 控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能使用，确 保培养基的质量符合要求。 培养基适用性试验 再验证 如果其中有任一控制点发生变化 ,应重新进行培养基适用性检查。 当检验结果出现异常或实验室质量控制需要，也可通过培养基适 用性检查提供一定依据。 培养基适用性检查试验 固体 培养基或原料变质不应 使 用； 配 制培养基储存过程中发现 浑浊、变色、 有 菌 生长 、严重脱水等变化不应再 使 用。 不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适用性试验确定。 除 特殊规定 外 ，培养基配制采用蒸馏水或纯化水，但应进行检测控制，如蒸 馏水 pH值应为 5 7。 尽量临用现配。 培养基适用性检查 配制培养基的保存 培养基灭菌后， 不得 在高压锅内过夜； 固体培养基灭菌或融化后，放置不得超过 8h； 培养基 于 2 25 保存，但不应超过 21 d； 固体琼脂培养基 熔化再使用应不超过 1次。 培养基适用性检查 菌种来源 国内外认可的菌种保藏中心。 试验用菌株的传代次数不得超过 5代（从菌种保藏中心 获得的干燥菌种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性 金黄色葡萄球菌 CMCC（ B） 26 003 铜绿假单胞菌 CMCC（ B） 10 104 大肠埃希菌 CMCC（ B） 44 102 乙型副伤寒沙门菌 CMCC（ B） 50 094 白色念珠菌 CMCC（ F） 98 001 生孢梭菌 CMCC（ B） 64 941 菌种及菌液制备 菌液制备 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌 胰酪大豆胨肉汤或在胰酪大豆胨琼脂 30 35 ， 18 24h 白色念珠菌 沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤 20 25 ， 2 3天 生孢梭菌梭菌增菌培养基 30 35 ，置厌氧条件下培养 24 48小时 菌悬液的制备 稀释剂 pH7.0无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。 菌悬液的贮存 若在室温下放置，应在 2小时内使用； 若保存在 2 8 ，可在 24小时内使用。 生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定的孢子悬液可保 存在 2 8 ，在验证过的贮存期内使用。 菌液制备 阴性对照试验 确认试验条件是否符合要求。 稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。 供试品检查时也需进行阴性对照试验。如果阴性对照有菌生长，应 进行偏差调 查。 培养基适用性检查 成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基 的适用性检查。 促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。 菌株见表 培养基适用性检查 控制菌 检查 培养基 特性 试验 菌株 耐胆 盐 革 兰 阴性菌 肠 道菌增菌肉 汤 促生 长 能力 大 肠 埃希菌 铜绿 假 单 胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 紫 红 胆 盐 葡萄糖 琼 脂 促生 长 能力 +指示特性 大 肠 埃 希菌 铜绿 假 单 胞菌 大 肠 埃希菌 麦康 凯 肉 汤 促生 长 能力 大 肠 埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 麦康 凯琼 脂 促生 长 能力 +指示 大 肠 埃希菌 大 肠 埃希菌 麦康 凯 肉 汤 促生 长 能力 大 肠 埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 麦康 凯琼 脂 促生 长 能力 +指示 大 肠 埃希菌 培养基适用性检查 沙 门 菌 RV沙 门 菌增菌肉 汤 促生 长 能力 乙型副 伤 寒沙 门 菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 木糖 赖 氨酸脱氧胆酸 盐琼 脂 促生 长 能力 乙型副 伤 寒沙 门 菌 +指示特性 三糖 铁琼 脂培养基 指示能力 乙型副 伤 寒沙 门 菌 铜绿 假 单 胞菌 溴化十六 烷 基三甲 铵琼 脂 促生 长 能力 铜绿 假 单 胞菌 抑制能力 大 肠 埃希菌 金黄色葡萄球菌 甘露醇 氯 化 钠琼 脂 促生 长 能力 金黄色葡萄 球菌 +指示特性 抑制能力 大 肠 埃希菌 梭菌 梭菌增菌培养基 促生 长 能 生 孢 梭菌 哥 伦 比 亚琼 脂 促生 长 能力 生 孢 梭菌 白色念珠菌 沙氏葡萄糖肉 汤 促生 长 能力 白色念珠菌 +指示特性 沙氏葡萄糖 琼 脂 促生 长 能力白 色念珠菌 念珠菌 显 色培养基 促生 长 能力 白色念珠菌 +指示能力 抑制能力 大 肠 埃希菌 培养基适用性检查 液体培养基促生长能力检查 接种不大于 100cfu的试验菌在不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基管试验菌应生长 良好。 固体培养基促生长能力 接种取菌悬液 0.1ml），涂布于培养基平板上，在规定的温度及时间下培养 。 不长于规定的最 短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形 态特征应一致。 培养基适用性检查 培养基抑制能力检查 接种不少于 100cfu的试验菌于被检培养基。不短于规定的最长培养时间下培养。 试验菌应不得 生长。 培养基指示特性检查 取试验菌悬液各 0.1ml涂布于培养基平板上在不长于规定的最短时间下培养， 被检培养基上 试 验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 修 订 前 大 肠 菌群的 验证 ，采取大 肠 埃希菌 为验证 菌株。 修 订 后 耐胆 盐 革 兰 阴性菌 检查 方法，采取大 肠 埃希菌和 铜绿 假 单 胞菌 为试验 菌 。 方法适用性试验 试验菌 修 订 前 验证 方法 取 规 定 量 供 试 液 及 10 100cfu试验 菌接入增菌培养基中依相 应 的控制菌 检查 方法 进 行 检查 。 当采用薄膜 过滤时 ，取 规 定量供 试 液， 过滤 ，冲洗， 试验 菌 应 加在最后一次冲洗液中 ， 过滤 后，注入增菌培养基或取出 接 入增菌培养基中 . 修 订 后 适用性 试验 按 控制菌 检查 法取 规 定 量 供 试 液 及 不大于 100cfu的 试验 菌接入 规 定 的培养基中； 采用薄膜 过滤时 ，取 规 定量供 试 液， 过滤 ，冲洗， 试验 菌 应 加在最后一次冲洗液中， 过滤 ,注 入 规 定的培养基或取出 滤 膜接入 规 定的培养基中。 依相 应 的控制菌 检查 方法 ， 在 规 定的温度及 最短 时间 下培养 ， 应 能 检 出 所加 试验 菌相 应 的反 应 特征 方法适用性试验 修 订 前 若 检 出 试验 菌，按此供 试 液制 备 法和控制菌 检查 法 进 行供 试 品的 检查 ； 若未 检 出 试验 菌， 应 采用培养基稀 释 法、离心沉淀法、薄膜 过滤 法、中和法等方法 或 联 合使用 这 些方法消除 供 试 品的抑菌活性，并重新 进 行方法 验证 。 验证试验 也可与供 试 品的控制菌 检查 同 时进 行。 修 订 后 若 检 出 试验 菌，按此供 试 液制 备 法和控制菌 检查 法 进 行供 试 品的 检查 ； 若未 检 出 试验 菌， 应 消除 供 试 品 的抑 菌活性。 如确 证 供 试 品 对试验 菌的抗菌作用无法消除，可 认为 受抑制的微生物不 可能 存在于 该 供 试 品中 ， 选择 抑菌成份消除相 对彻 底的方法 进 行供 试 品的 检查 。 方法适用性试验 结果判断 供试品检查 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。 阳性对照试验 试验方法 同供试品的控制菌，加菌量应不大于 100cfu。 应检出相应的控制菌。 供试品检查 耐胆盐革兰阴性菌 耐胆盐革兰阴性菌取代 2010年版大肠菌群检查 大肠菌群的定义 是指在 37 生长时能发酵乳糖， 24h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或 兼性厌氧的无芽孢杆菌。 符合上述定义的菌除埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷 伯菌属。 耐胆盐革兰阴性菌检查 检验程序 供试液制备 同 “ 非无菌产品微生物检查：微生物计数法制成 1： 10供试液，混匀。 预培养 在 20 25 培养，培养时间一般 2小时 ,使供试品中的细菌充分恢复但不增殖。 未检出试验 取相当于 1g或 1mL供试品的上述预培养物接种至 肠道菌增菌肉汤中。 30 35 ， 培养 24 48小时。 划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，置 30 35 ， 培养 18 24小时。 平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性 耐胆盐革兰阴性菌检查 定量试验 1、取定量供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌 增菌肉汤中。 30 35 ， 培养 24 48小时。 2、上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄 糖琼脂平板上。 30 35 ， 培养 18 24小时。 若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴 性。根据各培养管检查结果，从表 2查对 1g或 1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴 性菌的最大可能数。 表 2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数 各供试品量的检查结果 每 1g（或 1ml）供试品中可能的菌数（ N） 0.1g/ml 0.01g/ml 0.001g/ml N 103 102 N 103 10 N 102 N 10 供试品检查 大肠埃希菌 大肠埃希菌是肠杆菌科埃希菌属的代表种。 大肠埃希菌是两端钝圆的短小直杆菌，（ 1.1 1.5） m(2.0 6.0)m 单个或成 对，革兰阴性无芽孢，多有鞭毛培养最适温度为 37 可在 15-46 生长，兼性厌氧 。 修 订 前 取 1:10供 试 液至胆 盐 乳糖增菌（大 肠 、金葡） 18-24h MUG培养基（大 肠 ） 5h、 24h MaC琼 脂（大 肠 、指示） 18-24h 修 订 后 取 1:10供 试 液至 TSB（大 肠 、 金葡、） 18-24h MaC肉 汤 （大 肠 、 金葡） 42-44 24-48h MaC 琼 脂 （大 肠 ） 18-72h 方法适用性试验 大肠埃希菌检查 检验程序 取供试品，照附录 “微生物计数法 ”制成 1： 10供试液。 取相当于 1g或 1mL供试品的供试液，接种至适宜体积 的胰酪大豆胨肉汤中。 30 35 培养 18 24小时。 取上述预培养物 1mL接种至 100mL麦康凯肉汤中。 42 44 培养 24 48小时。 取麦康凯肉汤培养物划线接种于麦康凯琼脂平 板上。 30 35 培养 18 72小时。结果判断 -若麦康凯琼脂平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试 验 , 确证是否为大肠埃 希菌； -若麦康凯琼脂平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结 果为阴性，判供试品未检出大 肠埃希菌。 供试品检查 沙门菌 沙门菌为革兰阴性杆菌，无芽孢，菌体 通常（ 0.4 0.9） m(1 3) m ，两 端钝圆。需氧或兼性厌 氧， 10 42 皆可 生长，最适温度 37 。 检验 程序 修 订 前 营 养肉 汤 供 试 液（ 18-24h ) TTB (沙 门 、金葡） 18-24h SS / MaC 琼 脂（沙 门 、金 -） 18-48h RV 氯 化 镁 孔雀 绿 沙 门 菌增菌肉 汤 XLD 木糖 赖 氨酸脱氧胆酸 盐琼 脂 SS： 沙 门 、志 贺 菌属 琼 脂 XLD 木糖 赖 氨酸脱氧胆酸 盐琼 脂 修 订 后 TSB 供 试 液（ 18-24h ） RV肉 汤 （沙 门 、金葡） 18-24h XLD琼 脂（沙 门 、 指示） 18-48h 沙门菌检查 沙门菌检查 沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上生长良好，菌落为 红色、中心有或无 黑色。 鉴定试验 挑选疑似菌落穿刺接种于三糖铁琼脂培养基高层 斜面上培养 18 24小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。 结果判断 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上有疑似菌落生长， 三糖铁琼脂培养基 斜面为红色、底层为黄色 或斜面黄色、底层有黑色 应进一步进行适宜的鉴定试验 , 确证是否为沙门菌。 如果平板上没有菌落生长 , 或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性 三糖铁琼脂培养基 斜面未见红色、底层未见黄色 或斜面黄色、 底层无黑色 判供试品未检出沙门菌。 铜绿假单胞菌 形态特征 铜绿假单胞菌为革兰阴性、直或微弯曲的杆菌，其菌体的长短不一，短的为球杆 状，长为丝状，大小（ 0.5 1.0） m(1.5 3.0)m 。 除在硝酸盐培养基中以外都是专性好氧。 最适生长温度为 35 ，在 42 能生长， 4 不生长。 检验 程序 修 订 前 取 1:10供 试 液至 BL 18-24h 溴化十六 烷 基三甲 铵琼 脂 18-24h 绿脓 菌素 测 定用培养基 24h 修 订 后 取 1:10供 试 液至 TSB （ 18-24h ) 溴化十六 烷 基三甲 铵琼 脂 18-72h 铜绿假单胞菌检查 铜绿假单胞菌检查 检验程序 供试液制备 取供试品，照附录 “微生物计数法 ” 制成 1： 10 供试液。 取相当于 1g或 1mL供试品的供试液，接种至适宜体积的胰酪 大豆胨肉汤中 30 35 培养 18 24小时 。 接种 取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平 板上 。 30 35 培养 18 72小时。 鉴定试验 取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其它适宜方法进一步 鉴定。 确证试验 平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验 阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。 金黄色葡萄球菌 形态特征 金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属。 菌体呈球形或略呈椭圆形，菌体较小，直径 0.5-1.5m ，平均直径金黄色葡萄球 菌对生长的营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生 长温度为 37 ，最适生长 pH为 7.4。 修 订 前 1:10供 试 液至 营 养肉 汤 或 亚 碲酸 盐 肉 汤 18-24h ， 48h 甘露醇 氯 化 钠琼 脂 24-72h 抑制能力：大 肠 埃希菌接种量不大于 103 ，接种量 过 大，大 肠 埃希菌可生 长 修 订 后 甘露醇 氯 化 钠琼 脂 18-72h 抑制能力：大 肠 埃希菌接种量不大于 103 ，接种量 过 大，大 肠 埃希菌可生 长 。 金黄色葡萄球菌检查 金黄色葡萄球菌检查 检验程序 取供试品，照附录 “微生物计数法 ”制成 1： 10供试液。 相当于 1g或 1mL供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰 酪大豆胨肉汤中，混匀。 30 35 培养 18 24小时。 修订前 为亚碲酸钠（钾）肉汤或营养肉汤 选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上。 30 35 培养 18 72小时。 金黄色葡萄球菌检查 结果判断 若甘露醇氯化钠琼脂平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应 进行分离、纯化及适宜的鉴定试验 , 确证 。 若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或 疑似的 菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。 梭菌 为一大群厌氧或微需氧的粗长芽孢杆菌。 由于定义的简单，梭菌属是细菌中最大的属。 大多数梭菌的形态都很复杂多变，即使在同一菌株其形态也并非经常恒定，甚至 每次培养都有可能变化。 梭菌检查 修订版同 2010版 检验程序 取 1:10供试液至梭菌增菌培养基 48h 哥伦比亚琼脂 48-72h 取供试品 照附录 “ 微生物计数法 ” 制成 1： 10 供试液。 取相当于 1g或 1mL供试品的供试液 2份，其中 1份置 80 保温 10分 钟后迅速冷却。 将上述 2份供试液分别接种至适宜体积的梭菌增菌培养基中 。