(iii)血细胞分析的质量控制

血细胞分析的质量控制 四川省人民医院检验科 蹇启政 只要在工作中树立全面质量管理意识，采用多种方法作好血细胞分析仪的 质量控制，就能发出一分合格的检验结果，也才能在室间质评中取得好的成绩！ 室内质量控制和校准是全面质量管理中 的一个重要环节，是保证实验结果准确 的重要措施。 一、概述 从 1949 年美国 College of American Pathologists（简称 CAP）首先开始研究临床实验室室内质量控制（简称质 控）问题，美国学者 Levery 和 Jenning 于 1950 年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的 室内质控工作正式拉开序幕。 到 70 年代，实验室质量控制进入一个新的阶段-全面质量管理，推行 Good Laboratory Parctice（简称 GLP）。 进人 80 年代末期，GLP 的统一标准产生了，发展到“认证实验室”管理阶段。 全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学的实验室室内质控是 全面质量管理中的一个重要环节。 1基本概念 11 质量控制（QuailityContro，Q.C） 质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路 进行的。 l）确定控制的对象； 2）规定控制对象的标准（预期值）； 3）制定或选择控制方法和手段； 4）测量实际数据； 5）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预定误差范围，报警系发出 信号，反馈通道中断。 6）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。 质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的“控制限”进行比较的图。 这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的“可追查”性原因。 “可追查”性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。“控制限”是通过统计计算出来的，详细介绍见室内 质控程序。 1.2 校准品 1.2.1 校准品：参考物质，其值为校准功能中用的自变量。 1.2.2 校准等级：按照 VIM：19933）定义，校准是指“一系列的操作，用以在特定条件下建立定量值与相应标准 品的真值之间的关系，该定量值可能来自某一测量仪器或测量系统或者是某一物品或参考品测量的表达值”。此定义 提示需要一种参考测量程序来设定校准品的数值。不同要求的参考测量程序定义不同。最高计量学规则是一级参考测 量程序（选定方法），次级计量学规则是二级参考测量程序（由计量学会制定）或国际常规参考测量程序（由国际学 术组织制定）。在血液学领域，最新的就是先前提到的参考方法。无论是否有分类，如新的自动参数，最高计量学规 则可以是厂家选择的测量程序。每个测量程序用于校准品定值，分别代表一级校准品、二级校准品或厂家工作校准品。 血细胞计数参数还没有一级测量程序，或一级参考物。近年，国际常规参考测量程序在全血细胞计数的参数设置方面 已有进展。最近，如 XE-2100 的幼稚粒细胞计数新参数，其最高计量学规则可能就是厂家选择的测量程序。 1.2.3 厂家产品校准品：按照厂家常规测量程序定值，用于校准终端用户常规测量程序。如： SysmexSCS-1000、Coulter、Abbttol 血液校准品能用于 WBC，RBC，PLT，HGB 和 HCT 的校准，血细胞计数参数还 没有一级测量程序，或一级参考物。近年，国际常规参考测量程序在全血细胞计数的参数设置方面已有进展。最近， 如 XE-2100 的幼稚粒细胞计数新参数，其最高计量学规则可能就是厂家选择的测量程序。 1.3 全血质控物：采用醛化的人血，定值分装而成，只能用于质控，不能用于仪器的校准，两者不能混为一谈。 “好的开端是成功的一半”，分析前的 质量控制不容忽视，选择适当的质控方 式非常重要。 二、血细胞分析的质量控制 （一）分析前的质量控制 1.标本采集的质量控制：血标本的采取应注意的问题 1）采血试管 选用专做血常规的小型带盖的塑料试管或玻璃试管，内壁均需硅化处理，否则易造成血小板粘附，影响测定结果。 目前多采用真空采血管。 2）抗凝剂及比例 选用 EDTAKZ，室温下其溶解较快，特别适合全血细胞分析及红细胞比积测定，室温下 6h 红细胞体积不改变， 抗凝剂最好干烤在试管上，l.5mg 可抗凝 0 515ml 血液，当然抗凝剂浓度过高，易造成细胞外液高渗状态，影响细 胞的正常形态。抗凝剂浓度过低，起不到抗凝作用，血液中易产生凝块。 3）采血 采用静脉血，对难以采取的儿童或烧伤患者取末梢血。由于末梢血中混入组织液，造成血液稀释，可使各项测定 值偏低，末稍血血小板比静脉血一般偏低 2%5%。当然对于末梢血血小板采集时，由于采血量较大，还存在挤压使血 小板可能集聚，故取血要选择暴露明显的静脉等。 4）采血后标本的处理及放置时间 采血后的标本要轻轻充分混匀。混匀后宜放置 1015min，否则抗凝剂未充分与血液作用，易造成中等大小细胞 （MID）假性升高。若放置时间大于 6h，易造成血小板等有形成分破碎，使结果偏低。 2仪器工作环境的监测及控制：血细胞分析仪要求在无尘、无磁场、静电干绕、1530 度环境工作。 3仪器的校准及质控物测定 采用仪器厂家给定的校准液（有效期内使用），重复 3 次取均值。对 RBC、WBC、BPC 及 MCV 进行定期校准。校准 后用高、中、低三个质控液进行测定，如果测定值不在允许范围内，仪器需重新校准。 每月校正一次，每天进行质控物测定，并建立质控图，观察是否失控。 血细胞分析室内质量控制方式的选择及程序设计 1质控方式及设计过程 质控方式：适合于血细胞分析的质控方式有 1）Levy-Jeninings 质控图；2）利用浮动均值法对仪器进行质量控制； 3）Westgard 多规则质控等。 为了获得优化的性能，质控方法必须具有尽可能低的假失控概率（Pfr）和尽可能高的误差检出概率（Ped）。假 失控概率和误差检出概率将依赖于质控规则和在分析批上质控测定值的个数（N）。 1）Levy-Jeninings 质控图设计过程：通过以下步骤来确定质控范围。 最佳条件下的测定误差。最佳条件下已知值质控血清变异（oPtimalconditionsvariance，简称 OCV）的测定： 在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清 20-30 次，测得结果计算，求出该组数据的均值 和标准差（SD）表 D 示该实验室的最佳工作质量。 已知值的质控物在常规检验条件下的误差。常规条件下已知值质控变异 （routineconditionsvarianceknownvalue，简称 RCVK）的测定。 做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行 20 次检验，结果计算同 OCV 法。一般认为 RCV 的 SD 在 OCV 的 SD 两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向 OCV 的 SD 值靠近。在改 进实验室条件后，重新进行 RCVK 的测定。如果 DRCVK 的 SD 值更小说明 OCV 不具最佳条件下测定的，应重新再测 OCV。常现条件下，RCVK 肯定要比 OCV 大。通过质控控制各项条件，使 RCVK 的数据尽可能尽可能接近 OCV 值。RCVK 的 数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发。 未知值的质控物在常规检验条件下的误差。常规条件下，未知值质控物变异（routineconditionsvariancl- unknownvalue 简称 RCVU）的测定，有时为了避免主观性，再作 RCVU 测定。测定步骤同 RGVK，但检测的操作者不知质 控血清的定值，或在操作作者不知哪份是质控物的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小， 在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将 使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。 质控图 通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据 RCVK 的和 SD 作质控框图。一般认为：一次超出 3SD； 连续 M 次超出 2SD； 35 次连续处于一侧的 2SD 之内； 57 次连续偏向横轴的一侧，均为失控。第、种情况， 单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。 2）利用浮动均值法对仪器进行质量控制：仪器通过适当的设置，可每天随机抽取 20 份测定值进行统计。正常情 况下，其 MCH、MCV、MCHC 的均值都在一定的范围内，若有较大的波动，说明可能失控，应及时找原因。 3）Westgard 多规则质控图及设计过程简要介绍质控方法设计步骤 以“允许总误差”（TEa）形式规定每一试验的临床质量要求，如采用美国临床实验室改进修正案（CLIA88）能 力验证计划的评价限。 从 1 个月的质控物检测的值计算每一试验的稳定标准差（S）或变异系数（CV）；方法的不准确度（bias）是根 据参加卫生部临床检验中心室间质评计划确定（测定结果与靶值之间的偏差）。 计算临界系统误差（SEc）和临界随机误差（REc）：Sec=（TEa|bias|）/s1.65 REc（TEa|bias|）/1.65s（bias0） 由计算机模拟程序确定候选质控方法的性能特征。通过图形插入法可估计假失控概率和误 差检出概率。 设定质控方法检出系统误差概率 90%为目标，同时维持尽可能低的假失控。随机误差高检出率是其次考虑的目 标。 采用质控计算机模拟程序（QCCS）该程序由王治国开发，菜单提供多种质控规则，其中包括 12s，12.5s，13s，13s/ 22s/R4s 和 Westgard 多规则（13s/22s/R4s/41s/10x）。以 1000 模拟批获得失控概率的估计 值。 根据以上步骤，举例如下： CoulterJT 血液分析仪（库尔特试剂和质控物）进行控制方法的设计。其分析项目有血红蛋白、红细胞、白细胞、 血小板、红细胞压积、MCV、MCH、MCHC。 质量控制设计过程及设计步骤如下： 1.以“允许总误差”（Tea）形式规定每一试验的临床质量要求，本研究采用的允许总误差为美国临床实验室改进 修正案（CLIA88）能力验证计划的评价限； 2.从一个月控制物浓度值计算每一试验的稳定标准差（S）或变异系数（%）；方法的不准确度（偏差 bias）是根 据参加卫生部临床检验中心室间质评计划确定（测定结果与靶值之间的偏差）； 3计算临界系统误差（SEC）和临界随机误差（REC）： SEc=（TEa|bias|）/sl.65 REC=（TE 一|bias|）/1.65s（bias0） 4由计算机模拟程序确定候选控制方法的性能特征。通过图形插入法可估计假失控概率和误差检出概率。 5 选择控制方法检出系统误差概率 90%为目标，同时维持尽可能低的假失控。随机误差高检出率是其次考虑的目标。 质量控制计算机模拟程序（QCCS） 该程序由王治国开发，莱单提供多种控制规则，其种包括 12s，12.5s，13s，13s/22s/R4 s 和 Westgard 多规则 （13s/22s/R4s/41s/l0）。以 1000 模拟批获得失控概率的估计值。 计算的临界系统误差和随机误差被表达为测定方法标准差的倍数；例如血红蛋白的Sec=6.21 相当于系统误差等 于 6.21 倍的标准差；REc4.77 相当于标准差增加 4.77 倍。 表 1 每一试验项目的允许总误差、分析的不精密度（变异系数）、不准确度（偏差 biss）、临界 系统误差SEc 和临界随机误差REC 试验项目 单位 控制物浓度 允许总误差 CV（%）biss（%） SEc REC 候选控制方法的性能特征 图 1，2，3 分别显示的是几种控制规则检出系统误差的性能特征，其中 N 分别为 1，2，4。利用模拟研究获得的 功效函数图，即是失控概率与分析误差大小的关系图。对于下面的试验，血红蛋白、红细胞、白细胞、红细胞压积、 MCV、MCH、MCHC 用 l3s 控制规则（N=1）就能容易地达到 90%以上的误差检出目标。对于红细胞、红细胞压积用 l3s控 制规则（N2）就能容易地达到 90%以上的误差检出目标。对于血小板，使用 Westgard 多规则（l 3s/22s/R4s/41s/10） （N=2）可达到 90%的误差检出。图 4，5，6 显示的是这些控制规则检出随机误差的性能特征，其中 N 分别为 1，2，4。显然，医学上重要随机误差比系统误差更难以检出。 图 1 l2s， l2。5s， l3s， l3s /22s / R4s 控制规则检出系统误差的功效函数图（N=1） 图 2 l2s， l2。5s， l3s， l3s /22s / R4s 和 Westgard 多规则检出系统误差的功效函数图（N=2） 图 3 l2s， l2。5s， l3s， l3s /22s / R4s 和 Westgard 多规则检出系统误差的功效函数图（N=4） 图 4 l2s， l2。5s， l3s， l3s /22s / R4s 控制规则检出随机误差的功效函数图（N=1） 图 5 l2s， l2。5s， l3s， l3s /22s / R4s 和 Westgard 多规则随机误差的功效函数图（N=2） 图 6 l2s， l2。5s， l3s， l3s /22s / R4s和 Westgard 多规则随机误差的功效函数图（N=4） 对 CoulterJT3 血液分析仪器推荐的质控方法。 对于血液分析仪可能有不同的策略对其进行控制：对于不同的试验每批控制测定值个数（N）相同，但控制规则可 不同；对于不同的试验可选择特定的控制规则，但 N 可不同；再就是不同的试验可选择不同的 N 和控制规则。 很明显，不同的控制方法适合于在 CoulterJT 血液分析仪上的不同试验，在其它的仪器上也是这样。因此，仔细 的控制设计是必需的，且要求使用系统的方法开始于临床质量要求的规定（允许分析误差），把测定方法的性能（不 精密度）考虑进去，还要考虑控制方法本身的性能特征（误差检出概率和假失控概率）。 在使用这种设计步骤上，一旦知道临界系统和随机误差的大小，选择控制方法的任务就变得很清楚。大的临界误 差建议具有较少 N 和宽的控制限的控制方法是恰当的。小的临界误差表明需要较多的控制测定值和较窄的控制限及可 能多个规则的控制方法。重要的是要认识到临界误差的大小依赖于测定系统的分析性能，SEc 和REc 是临床质量要 求与测定方法标准差比值的函数。对于给定的临床质量要求，当测定方法不精密时，将导致小的临界误差；当测定方 法非常的精密时，将导致大的临界误差。不同的控制方法将适合于具有不同精密度的仪器系统；高的精密度一般允许 较简单和更具有成本-效率的质控设计。当精密度达到较高水平时，SEc 值将是 4.0 或更大。这样大的误差相对地将 容易被检出，如图所示。 对血液分析仪选择质控方法阐明了提高精密度如何影响质控实践。对于其临界系统误差超过 4.0 的试验，通过使 用 3s 控制限且每批二个控制测定值的规则（13s）就能进行有效的控制。如血小板具有 1.0 到 3.0 的临界系统误差， 采用了 Westgard 多规则控制方法；因为在稳定操作过程中这种分析物的精密度较差。可以采用一些特殊的方法，对所 有的样本和控制物进行双份测定，并求出双份测定值的均值，采用其它的控制方法进行检查。 这些特定的质量控制方法应用于其它的实验室依赖于是否存在类似的临床质量要求及是否可达到类似的分析性能。 由于此两者的不同，可采用不同的控制方法更适合于其它的实验室。但是一般的设计控制方法的步骤是适合于所有的 实验室，所有的仪器系统，及所有的分析物，由此可选择出适合于特定实验室每项试验的控制规则和控制测定值个数。 在此描述的质控设计过程依赖于功效函数的获得和恰当的应用。如果有了质量控制计算机模拟程序（QCCS），此程序 能提供许多不同控制规则，及联合控制规则的功效函数图。由于有了这一工具，能选出更适合于每项不同试验的控制 方法，并能预测分析方法的质量，对分析方法作进一步的成本-效率研究。 分析中的质量控制除了用质控方法对仪 器进行质量控制，对试剂及仪器的检测， 观察仪器运行状态必不可少。 (二）分析中的质量控制 1）试剂及仪器监测 仪器允许的试剂空白测定值 WBC 为（0.00.2）10 9/L，RBC 为（0.00.2）10 12/L，如果超过此范围应更换 试剂。仪器测定时，血小板一般不显示测定时间，若血小板（BPC）显示测定时间，而 WBC 的测定时间52s，或 RBC 测定时间7.2s，表明测定结果的偏高及易造成 WBC 及及 RBC/PLT 通道的阻塞，用自动清洗程序进行清洗。 2）利用质控方法对仪器进行质量控制 仪器通过适当的设置，可每天随机抽取 20 份测定值进行统计。正常情况下，其 MCH、MCV、MCHC 的均值都在一定 的范围内，若有较大的波动，说明可能失控，应及时找原因。 对检测器堵孔的处理堵孔常见原因有；采血时棉花纤维混人标本中，采血不畅；挤压造成纤维蛋白丝形成小凝块； 血标本通过微孔计数时，其中的蛋白质变性沉淀在孔道内而又未及时清洗，对于雅培 CD-1700 型血液细胞分析仪用自 动清洁宝石孔键即可。如还未清除，可以打开仪器前盖两块板，把 WBC 及 RBC/BPC 两块宝石孔拿下来用毛刷带蛋白酶 清洗液清洗即可。 3）对检测器堵孔的处理及观察仪器运行状态 测定过程中，观察仪器的运行状态，有无报警信号及堵孔，若遇堵孔可用次氨酸钠或酶液清洗仪器。 4）纠正病理因素对结果的影响 很多疾病可引起 RBC 及 WBC 计数结果出现偏高或偏低的情况。如血液病中有核 RBC 显著增高影响 WBC 的计数值。 可用校正公式： 白细胞实际数=白细胞计数白细胞计数（分类总数含有核红细胞数/涂片中分类计数有核细胞总数） 最后的分析可是体现检验师能力的最直 接方式！ （三）分析后的质量控制 1.利用直方图进行分析 细胞直方图既能给临床提供诊断参考数据，也可为操作人员提供对仪器工作状态和实验结果是否可信的监控。必 须在仔细分析直方图后，确定是否需要显微镜的检查再发报告。例如，对于白血病患者，不但要纠正 RBC、WBC 的计数 结果，而且要进行显微镜分类方能发报告。 常见需要显微镜分类的样本（三分群仪器） 1.1 血液中有幼稚细胞（如图 1）直方图显示，在单核细胞区出现一个高大的细胞峰，粒细胞峰左移，淋巴细胞峰 右移。显微镜目测分类：原粒细胞 76%、杆状核 1%、中性分叶 5%、淋巴细胞 18%。 12 异型淋巴细胞增多（如图 2）直方图显示，在 80150fl 区域出现一个双峰，200fl 以后无细胞。显微镜目测 分类：异型淋巴细胞 18%、杆状核 6%、中性分叶 58%、淋巴细胞 18%。该图与报道不尽一致，可能与样本取血量不足有 关。 13 嗜酸粒细胞增多（如图 3）直方图显示，在 90180fl 有一脉冲线增高的细胞峰。显微镜目测分类：嗜酸粒 细胞 25%、中性粒细胞 35%、淋巴细胞 36%、单核细胞 4%。 14 淋巴细胞增多（如图 4）直方图显示，只有 3590fl 区域一个细胞峰，粒细胞峰区域低平。显微镜目测分 类：淋巴细胞 69%、中性分叶 25%、单核细胞 2%、嗜酸粒细胞 4%。 15 单核细胞增多（如图 5）直方图显示，在 80130fl 区域有一增高的细胞峰。显微镜目测分类：淋巴细胞 23%、中性分叶细胞 66%、单核细胞 10%、嗜酸粒细胞 1%。 16 杆状粒细胞增多（如图 6）直方图显示，在 100180fl 有一个增高的细胞峰，MO 值 13.5B。显微镜目测分 类：杆状粒细胞 15%、中性分叶细胞 73%、淋巴细胞 9%、单核细胞 3%。 2血小板减少的样本 对于血小板减少的样本，我们根据血小板直方图提示，进行显微镜目测计数或再次用分析 仪进行测试，经复查后血小板仍然减少，首先排除仪器问题及操作人员的原因，然后进行相关原因分析，根据临床诊 断考虑是否可以出现血小板减低现象，如果答案不确定时，检验师要主动与临床医师联络，了解病情，共同磋商，必 要时请临床及时取血进行复查，复查后才能发出报告。我们遇到的血小板减少的样本可归纳为以下三种情况。 2.1 经重新取血复查后，血小板仍然减少。如肝胆疾病、放化疗、药物引起血小板暂时性减低等病人的初次住院 检查，分析仪测试与目测结果一致。 2.