




已阅读5页,还剩6页未读, 继续免费阅读
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
BDNF、TrkB 在岛叶慢性电点燃大鼠海马中的 表达及与学习记忆的关系 徐文中 王峰 张培松 任双来 齐江华 孙涛 * (宁夏医科大学,宁夏回族自治区颅脑疾病重点实验室,银川 750004) 摘要: 目的 研究岛叶慢性电点燃癫痫模型大鼠的学习记忆功能,检测脑源性神经 营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸蛋白激酶受体B(Tyrosine receptor kinase B,TrkB )在海马组织中表达,探讨BDNF、TRKB与岛叶点燃大鼠学习记 忆的关系。方法 成年SD大鼠随机分为模型组、假手术组、空白对照组,建立大鼠 岛叶慢性电点燃模型。用避暗试验方法检测岛叶慢性电点燃模型大鼠学习记忆功能, 采用免疫组化和western blot方法分别检测BDNF、TrkB 蛋白在海马组织中表达水平, 用RT-PCR检测两因子基因表达水平。结果 岛叶慢性电刺激点燃成功后第1天(即0 周) ,学习记忆能力点燃组与空白对照组、假手术组差异无统计学意义 (P0.05) 。点 燃2周点燃组避暗试验结果的LT为(48.873.42s)、 EN为(2.750.99次)、点燃3周点 燃组避暗试验结果的LT为(48.712.77s)、EN为(2.751.15次),与对照组(即点燃0 周)相比学习记忆功能增强(P0.05),点燃4周后与对照组比学习记忆功能明显下 降(P0.05) 。BDNF、TrkB表达均在24h达到高峰( P0.05) ,空白对照组、假手术 组无明显变化。组内比较,峰值及增幅均出现在23周内(P0.01),4周后较前几周 组明显下降(P0.05)。结论 岛叶电点燃大鼠学习记忆功能与BDNF、TrkB 在海马中 表达总变化趋势一致。BDNF、TrkB与岛叶点燃大鼠学习记忆功能密切相关。 关键词:岛叶;癫痫;BDNF;TRKB;海马;避暗试验;学习记忆 中图分类号: 文献标识码:A The expression of BDNF and TrkB in rat hippocampus and the relationship with learning-remembering ability in chronic electronic ignition of insular lobe. XU Wen-zhong , WANG Feng, ZHANG Pei-song ,REN Shuang-lai,QI Jiang-hua,SUN Tao. Ningxia Medical University,Key Lab of Craniocerbral Disease, NingXia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750004,China Corresponding author: SUN Tao, Email: . * 收稿日期:2010-09-17 基金项目:国家自然科学基金资助(30750014) ;宁夏自然科学基金资助( NZ09114) 通信作者:孙涛, E-mail:.c n 【Abstract】Objective To study the expression of active Skeleton Adjustment Protein(BDNF、TrkB) in rats Hippocampus in the model of insular chronic electricity- igniting epilepsy and investigate the relation between BDNF、TrkB and learning- remembering ability in the epileptic rat. Methods: To divide adult SD rats randomly into model, sham and control group, respectively. The Passive avoidance test was employed to test learning-remembering ability of rats and Immunohistochemistry and western blot was used to determine the expression of BDNF、TrkB in the hippocampus and RT-PCR was exploited to check the gene expression of the two factors.Result: There is no big difference of learning- remembering ability of rats among the igniting group or control group and sham groups ( P0.05) in the first week after insular chronic ignition when passive avoidance test was examined. The increased learning-remembering ability appeared in the 2nd week (LT: 48.873.42s;EN: 2.750.99),3 rd week(LT:48.712.77s;EN:2.751.15) after the ignition(P0.05). Conclusion: The general tendency of the expression of BDNF、TrkB in rat hippocampus after the chronic insular electricity ignition was consistent with the learning-remembering ability of epilepsy rats. BDNF and TrkB are closely associated with the learning- remember ability for epilepsy rats. Key words: Insula, epilepsy, BDNF、TrkB , hippocampus, learning and remembering ability, Passive avoidance test 癫痫是中枢神经系统功能失常脑科临床综合征,可引起认知功能损害。2008 年 Bekinschtein P 等研究发现脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor BDNF)及 其特定受体酪氨酸蛋白激酶受体 B(Tyrosine receptor kinase B,TrkB )在癫痫的学习记忆中 起到重要的作用,并将持久的记忆储存海马 1-3,但机制尚不明确。作为人类第五脑叶 的岛叶,对记忆、学习起着至关重要的作用 3-5。本研究应用避暗实验检测岛叶癫痫大 鼠学习记忆功能,检测 BNDF、TrkB 在其海马中表达,探讨 BDNF、TrkB 在岛叶癫 痫大鼠学习记忆的作用,初步了解岛叶起源癫痫引起认知损害的机制。 1 材料与方法 11 主要试剂 实验用抗体羊抗兔抗 BDNF、TrkB 购自 SANTA CRUZ 公司,蛋白实验 用试剂盒均购自南京凯基生物有限公司。硝纤膜及 ECL 发光试剂盒购自 PIECE 公司。 RT-RCR 试验用试剂盒购自上海生物工程公司。 1.2 实验动物及分组 健康 68 周 SD 雄性大鼠 180 只,体重(22515)g,由宁 夏医科大学动物中心提供,随机分为:岛叶点燃组、岛叶假手术组、空白对照组。点 燃组再分为:0 周(从点燃当天到点燃 6d)、1 周、2 周、3 周、4 周等亚组。每亚组 再取 1h、12h、24h 时间点检测。模型点燃成功率为 92.3%,模型成功率与大鼠体重未 见相关性( P0.05) 。每组大鼠 n=6 只 1.3 模型制作 大鼠麻醉后,固定于 SR-5R 型脑立体定向仪,正中切口,以前囟为参 考点;于枕、额骨区安放加固螺钉 3 个,螺钉兼做接地电极;参考 Paxinos 1:600,TrkB;1:750)4摇晃 12h,PBST 洗膜 15min3 次,滴加生物素标记的二抗(比例均为 1:1500),4摇床 3h,PBST 洗 膜 10min3 次后行 ECL 发光 5min,应用胶片曝光,扫入凝胶成像系统进行灰度分析。 1.9 统计分析 采用 SPSS11.5 统计软件包进行分析。所得数据以 s 表示,各组数据x 采用多因素方差分析,组间比较采用 LSD-t 检验。 2 结果 2.1 避暗试验 各组各个时间段大鼠空白对照组与假手术组比较,无统计学意义。点 燃组大鼠在点燃当天(0 周)潜伏期、穿梭次数与空白、假手术对照组无统计学意义, 点燃 2 周 、3 周与点然当天相比潜伏期缩短,穿梭次数减少(P 0.05),点燃 4 周 与前几周比较,潜伏期均缩短,穿梭次数增加( F=23.521,P0.01)。见表 1。 表 1 大鼠避暗试验结果 ( n=6) 分组 0 周 1 周 2 周 3 周 4 周 空白组 假手术组 点燃组 LT/s EN/次 LT/s EN/次 LT/s EN/次 55.002.83 3.331.02 54.672.73 3.331.03 56.252.01 3.420.93 55.332.16 3.321.03 54.332.16 3.321.02 54.832.82 3.331.04 55.012.61 3.331.04 53.161.95 3.630.87 48.873.42* 2.750.99* 54.832.86 3.331.05 54.832.22 3.331.05 48.712.77* 2.751.15* 53.833.06 3.311.03 55.162.86 3.460.89 37.541.59* 6.751.29* 与同组 0 周比较* P0.05,* P0.01;组间比较 P0.05, P0.01。 2.2 免疫组织化学结果 BDNF 免疫组织化学染色阳性结果表现为海马细胞胞质 成棕黄色,TrkB 为胞膜呈棕黄色。BDNF、TRKB 在试验各组为 1h 表达开始增加, 24h 达到高峰。其峰值高峰段维持在 23 周时间段内,4 周峰值明显降低。空 白对照组与假手术组无明显变化。图 1。图 2 BDNF阳 性 细 胞 百 分 率 0 10 20 30 40 50 60 0周 1周 2周 3周 4周分 组 百分 率( %) 空 白 组假 手 术 组点 燃 1h 点 燃 12h点 燃 24h TRKB阳 性 细 胞 百 分 率 05 1015 2025 3035 4045 0周 1周 2周 3周 4周分 组 百分 率( %) 空 白 组假 手 术 组 点 燃 1h点 燃 12h 点 燃 24h 1:1h 时 BDNF;2:1h 时 TrkB;3:24h 时 BDNF;4:24h 时 TrkB, “”示细胞阳性表达 图 2 点燃 1 周组 1h、24h 时间点海马细胞 BDNF、TrkB 的表达 400 2.3 RT-PCR 结果 maker 的对照下目的条带清晰可见,测定各条带的光密度值, BDNF、TrkBmRNA 在试验各组均表示出 1h 开始增加, 24h 达到峰值,同样其峰 值高峰维持在点燃后 23 周,空白组与假手术组无明显变化。图 3BDNF 及 TrkBmRNA 光密度值: TrkB光 密 度 比 值 00.1 0.20.3 0.40.5 0.60.7 0.8 0周 1周 2周 3周 4周 分 组 光密 度值 空 白 组假 手 术 组 点 燃 1h点 燃 12h 点 燃 24h BDNF光 密 度 比 值 00.2 0.40.6 0.81 1.21.4 0周 1周 2周 3周 4周 分 组 光密 度比 值 空 白 组假 手 术 组 点 燃 1h点 燃 12h 点 燃 24h a、b、c、d、e:GADPH;m:maker,A:0 周组 24h;B:1 周组 24h;C:2 周组 24h;D:点燃 3 周组 24h;E:点 燃 4 周组 24h 图 4 BDNFmRNA、TrkBmRNA 在海马中各周不同 24h 的表达 2.3 western 印迹结果 各个试验组大鼠海马中 BDNF、TRKB 均有表达, BDNF、TrkB 蛋白在各点燃组均为 24h 时表达高于 1h 与 12h 时间点( P0.01), 各组峰值蛋白相对量空白对照组比较,23 周峰值最高( P0.05) ,4 周峰 值明显下降( P0.01) 。空白对照组与假手术组无明显变化。图 5、6。 BDNF蛋 白 表 达 0 0.20.4 0.60.8 11.2 1.4 0周 1周 2周 3周 4周分 组 光密 度比 值 空 白 组假 手 术 组 点 燃 1h点 燃 12h 点 燃 24h TrkB蛋 白 表 达 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0周 1周 2周 3周 4周分 组 灰度 值 空 白 组假 手 术 组 点 燃 1h点 燃 12h 点 燃 24h 图 5 BDNF、TrkB 在各组不同时间点蛋白表达相对量 A:1h;B:12h;C:24h;D:空白组;E:假手术组;1:空白组;2:假手术组;3:1h;4:12h;5:24h 图 6 点燃 3 周刺激后 BDNF、TrkB 蛋白表达 3 讨论 BDNF 是神经元产生的神经营养因子,在脑内含量丰富,在 CNS 的发育过程 中,参与神经的可塑性,并参与调节学习和记忆过程。TrkB 是由酪氨酸激酶原 癌基因编码的一种神经营养素家族(Neurotrophins,NTFs)高亲和力受体, BDNF 必须与其受体 TrkB 结合,才能发挥其生物学功能。由于海马是研究脑的 学习和记忆功能的一个重点部位,癫痫患者以及各类癫痫动物模型中,均会出 现海马硬化的形态学改变,所以取海马作为分子生物学检测部位。 避暗试验可实现组间平行操作,对记忆过程特别是对记忆再现有较高的敏 感性。本实验研究发现点燃初期,大鼠的学习记忆功能与对照组无差异,点燃 23 周时,表现为潜伏期缩短,穿梭次数减少;而 4 周后差异更为明显,潜伏 期缩短,但穿梭次数却明显增多,说明大鼠对训练后学习内容记忆功能减弱或 缺失,所以认为岛叶癫痫大鼠初期学习记忆功能无明显改变,23 周间学习记 忆增强,达到 4 周以后学习记忆功能下降。 BDNF是一个重要的突触可塑性形成学习记忆的中介 1,而BDNF是由第一个作 为糖化前躯体的(proBDNF,然后转换到细胞之内的而成为成熟BDNF,储存和释 放刺激细胞形成学习记忆功能 2,而BDNF依赖性信号传导途径通过活化TrkB受 体,通过水解磷脂酶C(PLC)、磷脂酰环己六醇激酶-3(PI3K) 、细胞外信号 调节激酶(ERK) 、促细胞分裂活性蛋白激酶(MAPK)等的信号通路激活,通过 细胞内Ca 2+发挥作用,且也调节BDNF、TrkBmRNA的转化和蛋白向树突的运输, 这些机制是负责翻译能力和调节突触传递和突触形成,从而增强和维持学习记 忆功能 3。TrkB属于受体型酪氨酸蛋白激酶,是BDNF的特异性受体。BDNF与靶 细胞膜上TrkB受体结合,促进TrkB同源二聚体的形成,激活受体酪氨酸激酶活 性,导致该受体发生细胞内区域的酪氨酸残基的自身磷酸化,继而激活下游一 系列的酪氨酸磷酸化过程 4-10。酪氨酸磷酸化的TrkB作为BDNF信号转导途径的 中介将信号进一步传递给下游的衔接蛋白及其相关活性酶,从而参与促进学习记 忆功能机制。通过RT-PCR、western blot及免疫组化等技术研究发现岛叶癫痫 早期,BDNF、TrkBmRNA及蛋白的表达明显增加,其机制可能是神经系统受自发 性放电刺激后影响BDNF、TrkBmRNA的转录及翻译水平,使相应蛋白的表达增加 (即24h点明显高于1h、12h点,但随着癫痫的持续发作,表现为各周组24h峰值 不同,23周峰值最高) ,两因子相互作用,表现在突触可塑性、稳态可塑性, 使其在记忆巩固中起到核心作用,表现为苔藓纤维出芽(Mossy fiber sprouting, MFS)、突触重构等突触可塑性改变,从而提高了大鼠学习记忆功能; 表现在行为学实验,穿梭次数减少,潜伏期延长,以及在暗箱内活动路程明显 缩短。但随着蛋白在执行功能过程中逐渐降解及在长时间(约4周)的癫痫放电 刺激下BDNF、TrkB的关键酶(如钙钙调素依赖的蛋白激酶 II(CaMKII等)活 性的降低和Ca 2+电压门控通道功能的降低,使BDNF、TrkB逐渐减少,致使学习 记忆功能减退。行为学实验表现为穿梭次数增加、潜伏期缩短,暗箱活动时间 长等。分子生物学实验与行为学实验相平行。综上所述BDNF、TrkB对癫痫的学 习记忆等认知功能起到重要的作用,但机制尚未完全阐明,有待进一步研究。 参考文献: 1 Gabriele M,Carla S,Antonio RM, et al.TrkB Modulates Fear Learning and Amygdalar Synaptic Plasticity by Specific Docking SitesJ. Neurosci, 2009 , 29(12):1013110143 . 2 Annamaria C, Luisella BC, Roberta Z et al.BDNF Val66Met polymorphism and protein levels in Amniotic FluidJ.Neuroscience ,2010,4(2): 11-16. 3 Benoit P, Adrian B,Martn C et al.The M3-muscarinic receptor regulates earning and memory in a receptor phosphorylation/arrestin-dependent mannerJ.Pharmacology UK, 2010,5(1):9440-9445. 4 Tobias G, Regine O, Jorge H et al.The Developmental Origins of VoiceProcessing in the Human BrainJ.neuron,2010.3(10)852-858. 5 Munjal MA,Bharathi H,Ashok K S et al.Progress in neuroprote
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 房屋产权协议书
- 气象合作协议书
- 原始股转让协议书
- 旅游服务协议书
- 协议书还款时效
- 工伤赔付协议书
- 免租金协议书
- 知识保密协议书
- 在解除劳动合同协议书
- 离婚协议书女方起诉
- 铁路旅客运输服务普速列车设备设施规范课件
- 外聘电工安全协议书范本
- 金融科技监管法律法规-全面剖析
- COPD相关环状RNA circ_0000378通过调控miR-3529-3p抑制苯并a芘致COPD人支气管上皮细胞增殖的机制研究
- 自卸车基础知识培训资料
- 依伏卡塞片-药品临床应用解读
- 脱“瘾”而出 拒绝躺“屏”-小学生手机管理防沉溺家长会
- 高效团队合作与沟通技巧事务文书
- 直接证明与间接证明课件新人教选修
- 2025年江苏启晟集团有限公司招聘笔试参考题库含答案解析
- 华为ICT大赛2024-2025中国区实践赛(基础软件赛道)省决赛考试题库及答案(供参考)
评论
0/150
提交评论