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HepG2 转染的相关问题 点击次数: 1021 发表于:2008-08-31 22:03 转载请注明来自丁香园 来源:丁香园 geniusma 问: 准备做 hepg2 的转染试验了,实验室常用的的是 lipofectamine 2000,听说 hepG2 的转 染效率很低,并且这种细胞比较容易成团,这会影响转染效率吗?是否用 trypsin+EDTA 可以使其成为单个细胞不成团?哪种转染方法更适合 hepg2?需要改用电转吗?如果用 lipo fectamine 2000,加入的比例如何?请有经验的朋友告知详细情况,谢谢! 丁香园网友 starry913 认为: HepG2 用 lipo2000 在我们实验室做的转染效率很高的,可以到 7080% ,不必担心。不 需要用电转,磷酸钙法也可以有 4050%的 操作上主要注意: 1,细胞铺板时的状态很重要,应该在铺板前尽量消化为单细胞悬液,trypsinEDTA 充分 吹打即可 2,转染前 1 天铺板,待转染时密度刚好达到 8090%,不能太低,但是也不能长过(细 胞成团,堆积)。最好是刚刚长满,此时还在对数生长期 3,加入的质粒要去除内毒素,plasmid:lipo 约为 1:0.5-1:5。实际上采用说明书的推荐 量就很好,1:2.5 4,用前自己好好看一遍说明书,哈哈 丁香园网友 yangea 认为: HepG2 细胞的确相对于 CHO 等细胞而言转染效率比较低,但也只是相对。据我们实验室 的经验,用 lipofectamine 2000 转染 HepG2 完全没有问题,无论是瞬时转染还是稳定转 染,也无论是转一个质粒还是共转染两个质粒(转两个以上没有试过)。但有些问题需要 注意一下: 1、lipofectamine 2000 毒性比较大,所以建议转染 6 h 后换去转染培养基; 2、采用先铺板再转染的方式比采用同时转染的方式效率会高,但需根据实验需要设计, 如果采用前种方式,细胞的汇合度一定要在 80%以上再转染(说明书上好像是达到 90%) ; 3、采用 0.25%的 trypsin+0.02%EDTA 消化细胞传代,弯头吸管稍加吹打,可使细胞分散 的很均匀,消化的时间一定要掌握好,时间不够不易吹下且对细胞造成机械损伤,消化过 了成片脱落,再想吹打成单细胞悬液就不容易了; 4、根据脂质体介导细胞转染的原理,在质粒提取时要除去内毒素,否则会降低转染效率 ; 5、对于转染时 DNA 和脂质体的量说明书上有个推荐的范围,DNA (g ):Lipofectami ne; 2000 (l )=1:0.5 1:5,可在此范围内设几个梯度摸索一下,从而找到最适 比例; 6、转染时用于稀释脂质体和 DNA 的培养基一定是无血清的,血清会干扰转染,还有脂质 体稀释液和 DNA 稀释液要充分混匀并孵育足够时间,以使脂质体将 DNA 颗粒包裹好进入 细胞。 丁香园网友 starry913 认为: 隔天转染是最理想的,但这个条件和细胞生长速度,铺板密度,培养基条件相关,是要摸 出来的。 首先你的克隆的增殖速度要较快,这个和你的细胞代数,此前的营养状况有关,有时多次 传代后细胞状态会变差,贴壁时间过长,建议采用复苏后 1020 代内的。我们还用过高 血清(15%20%)来调整生长速度,但是这点有时会改变细胞激活或基因表达状态,慎 用 其次是接种密度。对于贴壁细胞我是不计数的,太麻烦,就算传代比例。一般 1:21: 3 传代可以 1 天长满。必要时候增加量。但是如果生长过慢,单纯增加铺板密度也没什么 意义,因为脂质体要求转染增殖期细胞的。此时还是要回到第一步去摸索。 10cm( 60cm2)到 6well(10cm 2)为 6:1,按你的目前描述算下来大约是 1:2 传代 ,比较合适的密度,所以主要问题应该在你的细胞状态上。不知道你的克隆生长速度怎样 ?或者传代最后保留的 Trypsin 太多了,最好吸掉或者用较多 Medium 终止。消化时间对 于细胞状态也很关键。 丁香园网友 sdy352 认为: 非常感谢 starry913 详细的解释。我的细胞一直长的很慢,故想在短时间内提高覆盖率。 我也尝试洗掉 trypsin,仍然不行。而且新的问题出来了,三天换一次培养基至 9 天时开始 出现短杆状异物,疑为染菌。继续培养就知道是出现染菌了。但异物形态变为点状,生长 速度极快。一两天就覆盖整个平板,现在很头疼,望大家不吝赐教。 丁香园网友 richardmjf 认为: 我也是在 HepG2 细胞的转染,听说这个细胞很不好转染,我师姐建议我用含有 GFP 标记 的质粒转染,与目的质粒同时做,可以评价目的质粒的转染效率,然后再进行后面的实验 。 1.转染没听说过用培养瓶做的,那样消耗脂质体太多了,脂质体 1.5ml 的就要 3000 多块, 一个瓶里要加至少 3 4ml 培养基,你可以按比例算一下大约需要多少脂质体。 2.HepG2 细胞长得比较慢,建议传代时密度稍微大一些,10000/孔(96 孔板)应该算比 较大了。第二天的时候细胞融合能到 80%左右。我种板时用的不含双抗的含有胎牛血清的 MEM 培养基,到转染时把培养液吸去,先加入 50l不含血清不含双抗的 MEM,然后加 入用不含血清不含双抗的 MEM 稀释过的混合了质粒和脂质体的液体。6h 左右后换液,加 入含有 10%胎牛血清和双抗的 MEM,继续培养。 3.不明白你的意思,“ 转染时加 DNA 或 RNA 时几微克是不是还需要换算阿? ”你的质粒应 该是浓度已知的比如*ug/l,按照说明书的要求每孔加入*ug,那你就可以计算出你要加 入的质粒有*ul。测定质粒弄得可以在紫外分光光度计上测定 OD260,然后进行换算,应该 是 OD260*?*稀释倍数=*ug/ml(?记不清了,RNA 的应该是 40)。 4.转染可以在 96 孔板中做,然后再做 MTT 就可以,转染不应该再培养瓶中做,太浪费了 而且不能保证脂质体与质粒充分的作用于细胞。 祝你好运,我最近也在做,HepG2 确实不好转,建议你先做一下预实验,然后摸索到好的 条件在大批量的做 MTT,我的惨痛教训,没做预实验直接进行下边的实验,一下做了 40 个孔,结果检测质粒根本没转进去,我的下边的试剂全都浪费了,将近 80 块钱呢。 丁香园网友 erenda 认为: HepG2 确实不好转,需要摸条件,可以先做预实验。脂质体转染试剂毒性比较大,建议用 FuGENE HD 或者罗氏专门转 siRNA 的,叫做 X-tremeGENE siRNA Transfection Reag ent。X-tremeGENE 适合转 siRNA 或与质粒共转。 楼上的悬浮法应该指的是边铺边转吧? 就
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