hplc-elsd 法测定复方丹参滴丸中人参皂苷rg1, rb1 和三七皂苷r1 的含量[j]

中药新药与临床药理. 2002, 13(3): 174-176 HPLC-ELSD 法测定复方丹参滴丸中人参皂苷 Rg1、R b1和三七皂苷 R1的 含量 黄永焯，王宁生 (广州中医药大学临床药理研究所，广州 510405) 关键词：复方丹参滴丸化学；人参皂苷分析；三七皂苷分析；色谱法，高压液相； 蒸发光散射检测器 摘要：目的: 建立复方分参滴丸中人参皂苷 Rgl和 Rb1，三七皂苷 R1的含量测定方法。方法： 应用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)，采用固相萃取技术对样品进行预处理， Hypersil NH2 柱，流动相为乙腈-异丙醇-10mmol/L 醋酸铵水溶液 (冰醋酸调 ph 5.0) (15:4:1)；流速：0.6mLmin -1，测定了复方丹参滴丸中人参皂苷 Rg1、R b1，和三七皂苷 R1 的含量。结果：该方法测定人参皂苷 Rg1、R b1，和三七皂苷 R1的线性范围为 1.010.0g， 其加样回收率为 95.3100.4%，日内精密度2%、日间精密度4%。结论: 方法简便准确， 可为三七制剂的含量测定方法提供借鉴。 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1003-9783(2002)03- 0174-03 复方丹参滴丸由丹参、三七和冰片等三味中药，经科学方法提取有效成分精制而成， 是治疗心血管疾病的常用药。其中三七 Panax Notoginseng (Burk.) F. H. Chen 是我国名贵的 中药材，其主要活性成分达玛烷系四环三萜类皂苷具有多种显著的药理作用，含三七的复 方制剂常以其作为指标成分进行含量测定。 采用高效液相色谱蒸发光散射检测法对复方丹参滴丸中人参皂苷 Rg1、R b1 和三七皂 苷 R1 进行了含量测定。在样品预处理中，采用固相萃取技术(SPE)直接对样品水溶液进行 净化处理，并采用 NH2 柱，以乙腈-异丙醇-10mmol/L 醋酸铵水溶液冰醋酸调 PH 5,0 (15:4:1)为流动相的 RP-HPLC 法，可取得满意的结果。 1 仪器与试药 Waters 515 高效液相色谱仪，Alltech500 蒸发光散射检测器，Waters Millennium32 色谱 工作站。安捷伦 AccuBOND II ODS SPE 柱(500mg，6mL)。 人参皂苷 Rg1 和 Rb1，三七皂苷 R1 对照品(中国药品生物制品检定所 )，复方丹参滴丸 (天津天士力公司)，乙腈（Merck 色谱纯） ，异丙醇（Tedia 色谱纯)，三蒸水，其他试剂均 为广州化学试剂厂分析纯。 2 方法与结果 2. 1 色谱及检测条件 色谱柱：大连伊利特 Hypersil 氨基柱（200 mm *4.0mm，5m） ；流动相：乙腈-异丙 醇-10mmol/L 醋酸铵水溶液 (冰醋酸调 pH 5.0)(15:4:1)；流速 0.6mLmin-1；柱温：室温； ELSD 漂移管温度：55；氮气流量：2.3Lmin。 在上述色谱条件下，人参皂苷 Rg1，和 Rb1，三七皂苷 R1 三者可达基线分离。 2. 2 样品供试品溶液的制备 精密称取复方丹参滴丸样品适量(约 0.25g)、精确加入 8mL 三蒸水，超声处理 10min 过滤，取滤液。精确移取 2mL 加于已处理好的 ODS 固相萃取柱(10mL 甲醇活化，5mL 水 平衡) ，先用 20%甲醇 3mL 淋洗，然后用 40%和 50%甲醇各 3mL 洗脱，一齐收集为 A 液； 再用 65%和 70%甲醇各 3mL 洗脱，一齐收集为 B 液。于水浴 60空气吹干。残渣精确加 入流动 相 1mL 溶解，过 0.45m 滤膜，取续滤液备用。A 液供测定人参皂苷 Rg1、三七皂苷 R1；B 液供测定人参皂苷 Rb1。 2. 3 线性关系 分别精密称取人参皂苷 Rg1，和 Rb1，三七皂苷 R1 对照品适量，用甲醇溶解配制成 0.2mgmL-1 的溶液，取此溶液 50，40，25，10，5L 依次进样，按色谱测定条件，测得 人参皂苷 Rg1 和 Rb1，三七皂苷 R1 的峰面积，用最小二乘法以进样量(g) 对数(lgX)对峰面 积对数(1gY)进行线性回归，回归方程分别为： Rg1：1gY6.1986+1.2751 1gX (r20.9987) R1：1gY6.1690+1.27851 1gX (r20.9996) Rb1，：1gY6.0608+0.2254 lgX (r20.9998) 线性范围为 1.010.0g。 2. 4 样品测定 取样品供试品溶液在上述色谱条件下测定，结果见表 1。 表 1 样品测定结果 （N=3） 人参皂苷 Rg1 人参皂苷 Rb1 三七皂苷 R1批号 含量/(mgg - 1) RSD% 含量/(mgg - 1) RSD% 含量/(mgg -1) RSD% 980513 2.2467 1.9 2.4294 0.4 1.0525 2.2 991016 3.2656 0.8 3.5655 2.2 1.2370 1.9 000431 3.0248 0.6 3.1051 0.8 1.2564 2.1 2. 5 精密度试验 日内精密度试验：取对照品溶液适量连续进样 5 次，测得各峰面积，计算 RSD。日间 精密度试验：取对照品溶液适量连续进样 5d测得各峰面积，计算 RSD。结果见表 2。 表 2 HPLC-ELSD 法测定人参皂苷 Rg1和 Rb1、三七皂苷 R1的日内和日间精密度(N5) 日内精密度 日间精密度测定 成份 进样量 /g 峰面积 RSD% 峰面积 RSD% 1 154455229346 1.9 154101927738 1.8 5 12398588198377 1.6 12251252367538 3.0Rg1 8 23251649186013 0.8 23345324326835 1.4 1 147690613292 0.9 146108849677 3.4 5 1.9 11214005358848 3.2R1 8 11410222216794 21822509194603 0.9 22095025486091 2.2 2 260348044259 1.7 259050836267 1.4 5 828865074598 0.9 8097676145758 1.8Rb1 10 1946647987299 0.45 19319150270468 1.4 2. 6 加样回收率试验 精密称取己知含量的样品适量，分高中低量加入一定量对照品，按供试品溶液制备项 下操作，制备溶液，测定，计算。结果见表 3。 表 3 加样回收率试验测定结果 测定成分 样品含量/mg 对照品加入量 /mg 测得值/mg 平均加样回收 率/% RSD% 0.26 0.4276 95.7 2.2 0.18 0.3567 98.9 3.5Rg1 0.1787 0.9 0.2685 99.7 2.7 0.12 0.1924 98.5 3.9 0.8 0.0878 100.4 0.8R1 0.0742 0.5 0.1232 97.9 2.7 0.3 0.4689 95.3 2.1 0.2 0.3815 98.9 3.4Rb1 0.1834 0.1 0.2819 98.5 2.9 2. 7 稳定性试验 取同一样品供试品溶液，分别在 0、2、4、6、8h 进样测定，测定结果表明在 8h 内稳 定，RSD 2.1%。 2. 8 重现性试验 取同一样品(批号 991016)，按供试品溶液制备项下操作，制备 5 份，按色谱条件测定 含量。结果人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、三七皂苷 R1 的含量(mg/g)和 RSD 分别为 3.2924(0.6%)， 3.6630(1.7%)、 1.1955(1.4%)(N5) 。 3 讨论 3. 1 三七中所含的人参皂苷 Rg1，和 Rb1、三七皂苷 R1 均为四环三萜类皂苷，紫外吸收 为末端吸收，与一些常用的有机溶剂的截止波长接近，影响测定。使用紫外低波长检测， 会给测定带来一定困难。ELSD 为一新型通用检测器，其信号响应与被测物的质量成正比， 而不依赖于被测物的光学特性及官能团，理论上可用于挥发性低于流动相的任何组分的检 测。它对无紫外吸收或为紫外末端吸收的物质如糖类、皂苷类、甾类等有较好的响应。 3. 2 曾对 C18 柱和 NH2 柱进行了研究，结果发现 NH2 柱在 12min 内即可将三者分离。C 18 柱需用梯度洗脱，才可在适当的分析时间内将其分离，而且对人参皂苷 Rg1 和三七皂苷 R1 的分离效果不甚理想。人参皂苷及三七皂苷是极性较强的化合物，氨基键合相为一种极性 的固定相，对它们的分离效果优于 C18 柱；而且对人参皂苷 Rg1，和三七皂苷 R1 可获得满 意的分离度。 3. 3 复方丹参滴丸中多为水溶性成分 1，而待测成分极性亦较大，如何除去其他成分对 测定的干扰，是预处理中首要解决的问题。在含皂苷样品预处理中，多用正丁醇液液萃取 2及 大孔树脂柱层析纯化 3, 4。曾对正丁醇萃取，中性氧化铝柱层析，大孔树脂柱层析分离及 SPE 技术对样品的预处理进行了考察。结果发现，采用 SPE 方法对样品进行预处理。除去 干扰成分的效果较好，而且具有样品用量少、操作步骤简单、快捷等优点。 3. 4 样品洗脱 A 液含人参皂苷 Rg1 和三七皂苷 R1，样品洗脱 B 液含人参皂苷 Rb1，由于 样品洗脱 B 液中有一未知成分其色谱行为与三七皂苷 R1 相似，而且此成分在 ODS 萃取柱 上的保留与洗脱条件与人参皂首 Rb1 一致，所以，为避免其影响 R1 的测定，未有将