iso4833-2003菌落总数的检测方法

ISO与美国 FDA的不同处 食品微生物检验方法（FDA 与 ISO对比） 内容提要： l 菌落总数检测 l 大肠菌群及大肠杆菌检测 l 金黄色葡萄球菌检测 l 沙门氏菌检测 l 单核细胞增生李斯特氏菌检测 菌落总数测定 菌落总数的概念 l 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能 于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。 菌落总数测定卫生学意义 l 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 l 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。 l 通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多 少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 FDA BAM 菌落总数测定流程 检样 xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品 选择 23个连续适宜稀释度 各取 1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA） 35 48 2h 菌落计数 FDA BAM 菌落计数方法 l 选择 25250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下： N=C/（1*n1+0.1*n2）*d l 所有平板的菌落数都不足 25CFU，报告 EAPC/ml（g）为25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count l 所有平板的菌落数都超过 250CFU，但不足 100/cm2 ，报告 EAPC/ml（g）为最接近 250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。 l 所有平板的菌落数都超过 100/cm2 ，计算平板的面积（直径为 90mm的平板面积为 65cm2），估计最高稀释度每 cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果， 报告 EAPC/ml（g）为65*100* 1/d。 l 无法计数的平板报告 LA（Laboratory Accident）。 l 最终结果保留前两位有效数字。按照 4舍 6入，5 是奇进偶不进。 ISO4833-2003 菌落总数测定流程 检样 xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品 选择 23个连续适宜稀释度 各取 1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量（1215mL） 平板计数琼脂（PCA）， 301 ，72 3 h 菌落计数 ISO4833-2003菌落计数方法 l 选择连续 2个稀释度不超过 300CFU的平板，且一个平板至少含 15CFU进行计数，计 算公式如下： N=C/（n1+0.1*n2）*d l 所有平板的菌落数都不足 15CFU，计算 2平板菌落的算术平均值 m，液体样品：NE=m 固体样品： NE=md-1 l 无菌生长：液体样品：less than 1; 固体样品：less than 1 d-1 l 最终结果保留前两位有效数字。 菌落总数测定几点说明 l 由于检样中采用 30/35有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些 特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。 l 鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而 在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字 不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。 菌落总数测定几点要求 l 每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过 15min，主要为防止细 菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼 脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。 l 检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在 的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时 间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。 l 检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平 板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于 4 放置，以便在计数检样时用作对照。 大肠菌群的定义 l 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 l 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染 有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学 方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆 菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠杆菌的定义 l 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 l 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC 试验（靛基质、 MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。 l 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌 （ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、 黏附性大肠杆菌（EAEC）。 卫生学意义 l 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。 l 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就 有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度， 也反映了对人体健康危害性的大小。 l 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原 菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行 HACCP管理中， 将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和 HACCP实施效果的评估指标。 大肠杆菌的生物学特性 培养特性： l 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最 适生长温度为 37，在 42-44 条件下仍能生长，生长温度范围 15-46 大肠菌群及大肠杆菌测定 MPN法检验流程（FDA BAM） 检样 50g+450ml稀释液 适当十倍稀释样品 选择 3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管 LST肉汤（每管 9mlLST肉汤并加有导管）， 每管接种 1mL 35 ，24 2h 48 2h 没有产气管 有产气管 报告阴性 接种 BGLB肉汤管 接种 EC肉汤 44.50.5 （水浴培养） 24 2h 48 2h 查 MPN表报告结果 产气管接种 EMB平板（35、 1824h） （大肠菌群） 从 EMB平板上挑取 5个可疑菌转 接到 PCA斜 面，进行革兰氏染色、IMVC 生化 鉴定、接 种 LST复检产气 查 MPN表报告结果（大肠杆菌） 大肠菌群测定MPN 法检验几点说明 l MPN检索表： MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加 10倍。 l 初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实 培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在 37分解乳糖产酸产气”。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有 数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检 测工作中，证实试验是必需的。 l 产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小）， 有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量， 多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气 的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体 产生，而应作进一步试验。 大肠杆菌测定EMB 选择性分离鉴别 EMB平板典型大肠杆菌菌落特征： 中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽 大肠杆菌测定EMB 选择性分离鉴别 l EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长； l 高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以 恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀； l 大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽； l 该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件 大肠杆菌测定革兰氏染色 基本步骤： l 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染 1min，水洗； l 滴加革兰氏碘液，作用 1min，水洗； l 滴加 95%乙醇脱色约 1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗； l 滴加番红复染液，复染 1min，水洗、待干、镜检。 l 结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 大肠杆菌测定生化鉴定 （表略） 金黄色葡萄球菌概述 l 根据伯杰氏鉴定细菌学手册，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。 l 金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、 痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎 等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要 取决于其产生的毒素和侵袭性酶。 金黄色葡萄球菌生物学特性 金黄色葡萄球菌呈球形，直径 0.8m 左右，排列成葡萄串状 ，无芽孢，无荚膜。 金黄色葡萄球菌生长特性 l 金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时 呈浑浊生长 金黄色葡萄球菌检验方法适用性 l MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄 球菌的食品。 l 直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于 10/g（ml）的食品。 l 增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。 金黄色葡萄球菌检验直接平板计数法 （FDA BAM &ISO） 检样（50g+450mL 稀释液） 适当十倍稀释样品 选择 23个连续适宜稀释度 吸取 1ml菌液按照 0.3mL、0.3mL、0.4mL 分别涂布于 3块 90mmBaird-Parker平板上（做平行试验） 35 ，4548 h 确证试验 报告 FDA BAM 金黄色葡萄球菌检验MPN 法 检样（50g+450mL 稀释液） 适当十倍稀释样品 选择 3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管 10% NaCl TSB肉汤， 每管接种 1mL 35 ，48 2 h 从生长的管中接种 1环划线于 Baird-Parker 平板上 35 ，48 h 确证试验 报告 FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证试验 1.凝固酶试验 l 方法：从平板上至少挑取 1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到 TSB/BHI肉汤中，置 35培养 18-24h。取肉汤培养物 0.3mL同 0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合，置 35培养，定 时观察是否有凝块形成，至少观察 6h。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。 l 结果判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+ 和 3+）的必须进行生化鉴定加以证实。 FDA BAM金黄色葡萄球菌确证试验 2.革兰氏染色 l 对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。 3.生化鉴定 l 过氧化氢酶试验 l 葡萄糖厌氧利用试验 l 甘露醇厌氧利用试验 l 金葡溶菌酶敏感性试验 l 耐热核酸酶试验（辅助 ISO 金黄色葡萄球菌检验MPN 法 检样（xg+9xmL 稀释液） 适当十倍稀释样品 选择 3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管 modified Giolitti and Cantoni broth， 37 ，2448 h 从变黑或出现黑色沉淀的管中 接种 1环培养物于 Baird-Parker 平板上 37 ，48 h 确证试验 报告 沙门氏菌属简介 l 1880年 E. Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885 年 Salmon与 Smith又分离出猪霍乱 沙门氏菌，以后取 Salmon氏之名为本菌属之名。 l 沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽 孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现 2000多个血清型，我国已发现血清型近 200个。 沙门氏菌属生物学特性 形态特征： 革兰氏阴性，大小为 130.40.9m 的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡 沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。 培养特性： l 沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 都可生长，最适生长温度为 37，最适 pH为 6.87.8。 l 营养琼脂平板上：3537培养 1824h，其菌落大小一般为 23mm，光滑、湿润、无 色、半透明、边缘整齐。 l 血平板上：中等大小的灰白色菌落。 沙门氏菌属的抗原 l 菌体抗原（O 抗原） l 表面抗原（K 抗原）：Vi 抗原和 M抗原 l 鞭毛抗原（H 抗原） l 纤毛抗原 FDA BAM沙门氏菌检验流程 前增菌 25g 样+225mL 乳糖肉汤 （肉制品、肉副产品、动物产品） 匀质 2min，室温放置 60 5min 混合均匀，测定调节 PH6.8 0.2 35、24 2h 选择性增菌 0.1ml+10mlMM（RV） 1ml+10mlTTB 42、24h （水浴培养） 35、24h 43、 24h（水浴培养） 含菌量高 含菌量低 分离培养 划线接种 选择性培养基（BS、XLD、HE） 35、2448h（BS） 生化鉴定 每个平板挑取至少 2个可疑菌（包括典型和非典型各 2个） 接种 TSI三糖铁、LIA 赖氨酸铁高层斜面（LIA 高层深 4cm） （松盖以保持有氧条件防止产生过多 H2S） 35、242h 弃去 尿素酶试验 卫矛醇、 氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验 阳性 阴性 血清学 血清学试验沙门氏菌的分类 报告结果 ISO6579沙门氏菌检验流程 前增菌 25g 样+225mLBPW 匀质 371、18 2h 选择性增菌 0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn 41.5 1、24 3h 37 1、24 3h （水浴培养） 分离培养 划线接种选择性培养基（XLD 和第二种选择性培养基，如 BS） 37、2448h（BS） 每个平板挑取至少 5个可疑菌进行纯培养和确认试验 37、243h 生化鉴定 TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、-牛乳糖、V-P、 吲哚试验 血清学 血清学试验沙门氏菌的分类 报告结果 沙门氏菌检验选择性分离培养 XLD琼脂： FDA BAM典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的具光泽 的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。 非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。 ISO中心黑色、周围由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。 菌名 菌落形态 鼠伤寒沙门氏菌 红色，有黑心 伤寒沙门氏菌 红色，有黑心 弗氏志贺氏菌 红色 大肠埃希氏菌 黄色，有胆盐沉淀环 粪链球菌 - 沙门氏菌检验选择性分离培养 BS琼脂： FDA BAM典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围的培养基通常 开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有晕环效应； 非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基不变色。 沙门氏菌检验选择性分离培养 HE琼脂： FDA BAM典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色,中心或几乎全 黑色。 非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。 沙门氏菌检验生化鉴定 TSI： 典型反应：斜面产碱（K）：红色；底部产酸（A）：黄色；产 H2S：黑色（少数不产） 沙门氏菌检验几点注意 l 冷冻样品解冻需在 45以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行 15min或 在 2-8，18 小时内软化。 为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清 学鉴定。 l 进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符 合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。 测试中应同时接种阳性对照菌株。 李斯特菌属简介 l 伯杰氏鉴定细菌学手册第 9版中，李斯特菌属有 7个种：单核细胞增生李斯特氏 菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua） 、西尔李斯特氏菌（L. seeligeri） 、威尔斯李斯特氏菌（L. welshimeri） 、绵羊李斯特氏菌（L. ivanovvi） 、 格氏李斯特氏菌（L. grayi） 、默氏李斯特氏菌（L. murrayi） 。 l 单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起动物的感染，也可引起人 的感染。 单核细胞增生李斯特氏菌生物学特性 培养特性： l 生长温度为 242（冷藏不能阻止该菌的生长），最适生长温度为 3537。2025 培养有动力，37 培养动力消失；在显微镜下观察该菌新鲜的室温肉汤培养物可见翻筋斗运 动。 l 在 pH3.84.4仍能生长，在 pH中性至弱碱性（9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略 高的条件下该菌生长良好，在 6.5%NaCl肉汤中也能良好生长。 l 血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺种血平板可产生窄小的 溶血环。 FDA BAM单核细胞增生李斯特氏菌检验流程 检样 25g 增菌 EB 增菌液基础 225mL 30 4h 加入抑菌剂 30 20h 30 44h 选择性分离培养 接种 OXA和 PALCAM 接种 OXA和 PALCAM 35 24-48h 35 24-48h 生化鉴定 TSA-YE 纯培养 30 24-48h 典型运动 TSB-YE 过氧化氢酶试验 革兰氏染色 溶血试验 ISO单核细胞增生李斯特氏菌检验流程 测试样品（x g 或 x mL）+9x mL 一次增菌培养基（Half Fraser 肉汤） 30培养 242h 1mL培养液加入 划线接种 Oxford琼脂 10mL二次增菌培养基中 和 PALCAM琼脂 （Fraser 肉汤） 35或 37培养 482h 30、35或 37培养 24-48h 划线接种 Oxford琼脂 和 PALCAM琼脂 30、35或 37培养 24-48h 李斯特菌属的确证： 挑取可疑菌接种 TSAYE培养基 过氧化氢酶试验 革兰氏染色 动力试验 单核细胞增生李斯特菌的确证： 溶血试验 碳源利用试验 CAMP（协同溶血）试验 单核细胞增生李斯特氏菌溶血试验 l 制备 57%羊血琼脂平板。 l 挑取 TSAYE平板上的典型菌落刺种血平板，刺种时避免接触到平板底部和使琼脂破裂， 同时接种阳性（单核细胞增生李斯特氏菌）和阴性（英诺克李斯特氏菌）对照。 l 单增呈现狭窄、清晰、明亮的 -溶血； l 西尔李氏菌出现弱的溶血现象； l 绵羊李氏菌通常呈宽的、轮廓清晰的 -溶血； l 英诺克李氏菌不产生溶血现象。 单核细胞增生李斯特氏菌协同溶血试验（CAMP） l 方法：在羊血琼脂平板上平行接种 -溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌 (R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在 30培养 24h-48