ldl亚组份及其临床应用,南京090506全

低密度脂蛋白亚组份及其临床应用 南通大学附属医院 王惠民 丛辉 全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。目前，我国心 脑血管疾病患者已经超过2.7亿人,我国每年死于心脑血管疾病近300万人，占我们国每年总 死亡病因的51%。而幸存下来的患者75%不同程度丧失劳动能力，40%重残。我国脑中风病人 出院后第一年的复发率是30%，第五年的复发率高达59%。而二级预防做得较好的美国仅为 10%108。在心脑血管病的发病原因中，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是主要原因， 它是高血压、冠心病（CHD）、急性心肌梗塞（AMI）、脑中风等缺血性脑血管疾病的发病 基础 109。 人血浆低密度脂蛋白(LDL)在AS过程中作用已被人们所公认，但LDL存在着不均一性， 是由形状相似、大小不一的颗粒组成的集合体 50。探讨LDL亚组份的形成机制及不同组份 对动脉粥样硬化形成的作用，以至进一步了解不同LDL亚组份的临床应用价值，一直是近年 来血脂专家们的研究目标。但由于LDL亚组份的分析方法十分繁杂，大多运用超速离心技术， 使的LDL亚组份的研究和应用进展缓慢。近年来随着LDL亚组份检测技术的进步，可望在临 床得到更广泛的应用。 一、LDL 亚组份类型 自从用超速离心技术分离脂蛋白发现存在着乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白（VLDL）、 LDL、高密度脂蛋白（HDL）四种组份以来，逐步认识到脂蛋白颗粒实际上连续不均一的。 Krauss等 1于1982年用梯度凝胶电泳方法首先在一例高三酰甘油(TG)患者发现LDL颗粒的大 小和密度存在着不均一性，提出了“LDL亚组份”概念。Fisher 2将这种不均一性称之为 “多分散性”,有别于以前认为的LDL存在的单分散性。Austin等 3于1988年研究了各种亚 组份的颗粒大小，把LDL亚组份又归为两种谱型，将颗粒直径大于25.5nm归为谱型A，颗粒 直径小于25.5nm归为谱型B。Griffin等 4于1990年通过密度梯度超速离心根据LDL颗粒密度 不同而分为三个亚组份，其划分标准如下：LDL1(1.0201.035g/ml)， LDL2(1.0351.045g/ml)，LDL3(1.0451.060g/m1)。 Gardner等 5于1996年用密度梯度超速离心结合亲和层析法按密度和颗粒大小将LDL分 为215个亚组份。虽然学者们报道了多种划分LDL亚组份的方法，但多数采用梯度凝胶电 2 泳与密度梯度超速离心两种方法。前者多采用2%16%连续凝胶，而后者的条件较不统一， 因而所得结果差异较大。如梯度凝胶电泳易于分开LDL2与LDL3；而密度梯度超速离心易于 分开LDL1与LDL2。鉴于方法学上的不统一,导致了研究结论的不一致, Gardner等 5主张按 照Austin等的方法将LDL分为二类,谱型A是大而轻的LDL（large，buoyant LDL，lLDL）, 谱型B是小而密LDL（small，dense LDL，sLDL） 。其后的研究发现sLDL在动脉粥样硬化中起 着十分重要的作用，因此成为近年来的研究热点。 二、sLDL 的生成 大部分的研究证实，sLDL的生成与三酰甘油有关 3，6，7 尤其是与富含三酰甘油的VLDL 代谢有关。当肝细胞合成三酰甘油减少时，肝脏释放小颗粒、含三酰甘油低的 VLDL（VLDL2）入血，在肝脂肪酶的作用下,该VLDL内的三酰甘油逐渐被水解，转变为大而 轻LDL及中密度LDL(ILDL)；当肝细胞合成三酰甘油较多时，肝脏释放颗粒大、含三酰甘油 高的VLDL（VLDL1）入血，在肝脂肪酶作用下该VLDL内的三酰甘油被水解，主要转变为 sLDL。 另外，在VLDL升高时尤其当血浆三酰甘油水平超过1.5 mmol/L 时，虽然总LDL水平与 LDL的合成未变，但LDL中的胆固醇酯在胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP )作用下转移至VLDL，而VLDL的三酰甘油转移至LDL。当LDL中三酰甘油增加 至一定程度经肝时被肝脂肪酶水解除去三酰甘油，整个交换的结果是LDL的核心成分 - 胆 固醇酯减少，颗粒变小，lLDL及ILDL转变成sLDL。三酰甘油水平越高，VLDL与LDL的脂类交 换越活跃，生成的sLDL越多。 8，9,53,54 一些研究表明,LDL 的不均一性与遗传因素 56和环境因素 57有关，sLDL 存在着常染色 体的决定簇和共决定簇模式，抽烟等因素可改变基因的表达，从而影响 TG 水平和 LDL 的大 小 58，59 。LDL 的不均一性还受到饮食 57，60，61 、HDL-C 62、CETP 的基因多态性 63-66、脂 蛋白脂酶 66，67 和 Apo A-V68，69 等因素影响。LDL 受体的基因型，也会影响 LDL 颗粒大小 70。 进一步研究发现，肝脂肪酶在 sLDL 的生成中也起着非常重要的作用 10，66，71 ，肝脏中 脂肪酶活性越高，血清中 VLDL1 越高，从而导致 sLDL 升高。因此有人将肝脂肪酶看成是 sLDL 的遗传表型，推测其遗传性为 35%45% 11，肝脂肪酶受性激素影响，这可解释正常 男性 sLDL 高于正常女性，这与肝脂肪酶的分布一致，也佐证了肝脂肪酶在 sLDL 生成中的 作用 50，55 。 3 目前人为 VLDL1、CETP、肝脂肪酶在 sLDL 形成过程中起关键作用 12。 三、sLDL 致动脉粥样硬化原理 在AS的发生发展中，脂蛋白在动脉管壁沉积是一系列的过程，它首先存留于管壁一定 部位，然后被单核巨噬细胞或平滑肌细胞摄取。血管内膜细胞外基质含有硫酸软骨素蛋白 聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)，可与脂蛋白结合形成复合物，从而延 长脂蛋白滞留在血管内膜下的时间 13。体外实验表明这种与CSPG结合的LDL更容易被单核 巨噬细胞摄取 14，使脂类聚集而转变为泡沫细胞，在此基础上形成AS。 Anber等 15发现sLDL较lLDL与CSPG有更强的亲和力，血浆sLDL水平超过2.6 mmol/L 者 较低于2.6 mmol/L 者形成的CSPG-LDL复合物明显为多。sLDL的这种特性可能在致AS过程中 起重要作用。Skalen等 16推测其重要原因在sLDL中apoB的构像发生了改变，使得apoB上的 结合位点更易与CSPG结合，而与LDL受体的结合受到影响。 Nigon等 17发现sLDL与细胞表面LDL受体的结合力显著低于lLDL，因而从血浆中清除的 速率慢。Schaefer等 18研究证明sLDL较lLDL难以在循环中被清除，有更多的机会进入动脉 管壁。有作者证实sLDL在血中的延迟时间约为5天，而lLDL则为2天。De Graaf等 19发现， 在体外sLDL容易被氧化。Tribble等 20通过检测血浆硫代巴比妥酸反应物质 (thiobarbituric acid reactive substances，TSARS)生成率发现，sLDL的血浆TSARS生成 率较lLDL高，提示在自由基的作用下sLDL较lLDL易被氧化。Rijke等 21发现sLDL分子中维 生素E和辅酶Q10含量低，因而内在抗氧化能力减弱。氧化LDL可抑制依赖于内皮的血管扩张 及促使内皮的功能不全 79，80 。有作者发现sLDL与血浆纤维蛋白原升高有关 81，82 ，而后者 又称为冠心病的危险因子，而sLDL与plasminogen activator inhibitor-1 成反比 83，而 后者与纤维蛋白溶解有关。 以上研究均说明sLDL可以有较强的致AS作用。 四、sLDL 的测定方法 sLDL的测定方法主要分为梯度凝胶电泳法、密度梯度超速离心法、生化检测方法、毛 细管电泳及微流控电泳、其它方法等5类。 1 梯度凝胶电泳 (gradient gel electrophoresis，GGE) 73 最早由Krauss等 1应用，采用216聚丙烯酰胺凝胶梯度，根据其颗粒大小不同将 LDL颗粒分为A、B 以及中间亚型。Rajmen等 22应用连续梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法, 在90 4 min内可将LDL分出7条区带。GGE是一种简单，容易操作的测定LDL颗粒大小的方法，只需微 量的血清或血浆可同时对多个样本进行检测，但比较耗时, 一般至少需24 h。 目前美国Quantimetrix公司开发了一种称之为Lipoprint System商品仪器与试剂，主 要根据梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳、苏丹黑染色，显著提高了自动化和缩短了测定时间 75，76，106 ，该法已成为美国学者常用的方法。 2 密度梯度超速离心（density gradient ultracentrifugation，DGUC） 密度梯度超速离心法 23，72 是将血清加入到已有不同密度梯度的分离液中，在10下 采用垂直转子65,000 rpm 离心 70 min 后，血清中脂蛋白的各种成份可以转移到各自相等 密度的区域。这种方法可以一次将脂蛋白中的各种成份分离。而不足之处是对离心时间的 要求很严格，分开各种组份较困难。Davies等 24使用碘克沙醇梯度超速离心法 3h 内分离 了sLDL。所有超速离心法都有它们的局限性，实验室要求条件高，一般实验室都难以应用。 3 生化检测方法 3.1 推算法 血清中 90% 以上的载脂蛋白B（apo B）位于LDL颗粒的外壳，apo B的浓度可大致反映 LDL颗粒的数量 77，78 。研究发现 LDL-C/apo B为1.2时，相应的LDL颗粒直径为25.5 nm。 当比率小于1.2 时，可推论有大量 sLDL存在 25。 普遍的观点认为，血清TG水平是LDL颗 粒大小的主要决定因素，Maruyama 等 26推荐将TG/HDL-C比值作为评估 sLDL 的良好指标。 他们发现75%的sLDL增加的受试者血清中此比率大于0.9（单位符号为 mmol/L）或大于 2.0（单位符号为 mg/dL） 。 3.2 化学沉淀法 改良的肝素-锰沉淀法采用微孔滤器滤出lLDL、ILDL和VLDL，然后收集含有sLDL和HDL 的滤过液，通过全自动生化仪定量检测sLDL中的胆固醇 27。这种方法比较快速、简单，但 容易导致不完全沉淀, 造成sLDL-C测定不准确。 Hirano 等 28，74 利用肝素-氯化镁沉淀， 可将VLDL、Lp（a）、lLDL沉淀，经高速离心后HDL与sLDL位于上清液中，再用自动生化仪 测定上清液中sLDL-C。我们将该法进行了适当改良，使其有良好的重复性，批内CV与批间 CV分别为2.0%和4.5% 29。这类方法将sLDL-C测定与全自动生化分析仪相联系，为能在常规 临床应用奠定了基础，目前主要的研究热点是如何省略离心步骤而能直接进行测定。 Usui等 105在用化学沉淀剂沉淀后，取出LDL部分再以HPLC方法进一步分离sLDL。 4. 毛细管电泳与微流控电泳法 5 4.1 毛细管区带电泳 2004年Liu等用pH 7.4的磷酸盐缓冲液将LDL分为迁移率快、慢两种亚型 30，此研究指 出，健康人血清中的迁移率快的LDL亚型在动脉粥样硬化患者中减少，迁移率慢的LDL亚型 （sLDL）的增加与动脉粥样斑块的形成相关。我们曾用Beckman-Coulter公司P/ACE MDQ 毛 细管电泳仪进行区带电泳,可将血清脂蛋白分成三条区带,但不能分离LDL亚组份 31。此类 方法分辨率较差,一般只能将4种脂蛋白区分开来,很难将亚组份分离。 4.2 毛细管等速电泳（capillary isotachophoresis，CITP） CITP是采用不连续介质的电泳技术，即在前导电解质和尾随电解质所组成的非连续介 质中进行电泳。CITP的最大特点是能将分离后的组份压缩为一个个很窄的区带，从而达到 提高分辨率的目的。Schmitz 等 32于1997年等利用CITP 在7min内将脂蛋白分成9条区带， Bo等 33在2005年用CITP定量分析血清中LDL亚组份，对用非诺贝特治疗前后的IV型高脂蛋 白血症的患者进行了疗效观察，发现治疗后患者血清中的sLDL明显减少，他们随后的研究 34 指出 CITP 分析的快速迁移低密度脂蛋白（sLDL）与颈动脉内膜-中膜厚度（CA-IMT） 密切相关，可作为 CA-IMT 增加的强预测指标。我们于2005年利用CITP 将血清脂蛋白至少 分为9条区带 35，LDL至少分为三条区带,并初步显示对心血管疾病有一定诊断价值。 4.3 微流控芯片电泳（microchip electrophoresis） 微流控芯片电泳是在传统毛细管电泳的基础上发展起来的，在石英、玻璃、塑料等基 片上刻蚀出微米级的电泳管道, 它使传统毛细管电泳分离物质的整个过程可以在一块几平 方厘米的基片上得以实现。微流控芯片电泳具有微量、快速、分辨率高等优点，具有良好 的应用前景。 Weiller等 49于2002年以微流控芯片电泳为平台，选择了NBD为脂蛋白特异性染料，在 5min内可将脂蛋白标准品分离为HDL与LDL，但区带拖尾现象严重，意味着存在微管道对蛋 白质的吸附，该文没有临床病例监测报告。我们在国内外率先利用自制的微流控芯片结合 激光诱导荧光检测系统，可将脂蛋白分离成CM、VLDL、lLDL、sLDL等4个脂蛋白峰，sLDL的 峰面积和迁移时间的CV值分别为2.9%和2.2%,在3min 内即可完成电泳分离,是目前最简便、 快速和准确的分离检测sLDL的分析手段之一 3638 。 5其它分离分析方法 5.1 质子核磁共振（nuclear magnetic resonance ，NMR）光谱法 NMR光谱法 39 根据LDL颗粒外壳的磷脂信号强度测定直径，根据内核胆固醇酯和TG的 甲基团的数量测定脂质浓度。NMR 光谱法的主要优势在于能够同时快速测定LDL颗粒大小及 6 亚型浓度。但由于需要特殊的实验设备，NMR光谱法没有被普遍推广使用。 5.2 体积排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）法，电子显微镜技术， 动态光散射法。 SEC 是一重现性高、精确的测定LDL亚型的技术 40。血清脂蛋白经超速离心后，紫外 分光镜在280nm处检测流过色谱柱的LDL组分，根据LDL峰的滞留时间计算LDL的直径。 电子显微镜技术直接观察sdLDL。血清脂蛋白经超速离心后立即用含有345 pM 乙二胺 四乙酸（EDTA）的 0.134M醋酸铵透析，然后进行负染，电子显微镜观察颗粒直径 41。 动态光散射（dynamic light scattering）法 42是用配置了2016稳频管氩离子激光器 （514.5nm）的NICOMP 270型粒子尺寸仪（Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA ）测量经过超速离心得到的LDL亚型的直径。 以上三种方法需要先经过超速离心获得LDL亚组份，再通过特殊仪器对sLDL 进行鉴定 和测量,只能用于研究工作。 五、sLDL 的临床应用 1. 与心血管疾病的关系 Haskell等 43在Stanford冠心病危险因素干预研究(SRCIP)中，对300例经血管造影证 实为冠状动脉疾病者，进行4年的随机分组危险因素干预试验发现，尽管病人的患病及饮食 状况类似，药物降低总LDL-C的水平也类同，但AS进程的减慢的情况只出现在sLDL显著降低 时。同时该研究还发现，即使lLDL通过治疗其水平大大下降，但此类患者同对照组相比， 并无明显的AS进程减缓现象发生。Lamarche等 44在Quebec 心血管疾病研究中，随访2103 倒男性无缺血性心脏病5年，其中114例发生CHD。通过年龄、体重指数、吸烟史和饮酒史等 配对选择健康对照组，运用非变性梯度凝胶电脉法分离LDL各亚组份，发现颗粒小的LDL能 显著增加研究对象以后发生CHD的可能性。 Austin等 3用梯度凝胶电泳法分析了109例心肌梗死存活者和121例对照者的血浆LDL亚 组份，发现心肌梗死患者血浆主要含sLDL，对照者血浆主要含lLDL。并且表明含sLDL的个 体较含lLDL的个体发生心肌梗死的危险性高3倍，与年龄、性别、相对体重不相关，而与 HDL及高TG水平相关。Griffin等 45用密度梯度离心法分离LDL亚组份，发现46例经冠状动 脉造影确诊的冠心病患者血浆sLDL超过2.6 mmol/L占54 ，24例冠状动脉造影阴性者中仅 占2l ；40例心肌梗死存活者中占74 ，而58例正常对照者中仅占28。血浆sLDL水平 升高时，发生冠心病和心肌梗死的危险性分别比正常对照者高45倍及69倍。且经校正 7 三酰甘油、年龄、体重指数、吸烟及药物等多变量分析表明，sLDL仍然同冠心病和心肌梗 死呈高度相关。 84-88 有研究显示正常人LDL颗粒偏小时,患AMI的风险增大,如LDL颗粒大小的峰值减少 0.8nm,7年后患AMI的风险增加37% 89。如果C反应蛋白与sLDL同时升高，有更高的AMI风险 90，也发现sLDL与AMI的严重性有关 91。不少患者经降胆固醇治疗后虽然LDL-C降正常， 但仍可发生AS ，进一步研究发现该部分患者sLDL 仍然异常 110。因此sdLDL被称为“致AS 脂蛋白”、 “CHD独立危险因子”等 111，112 。 Aikawa等 46研究了33只新西兰白鼠，首先给予它们致动脉粥样硬化饮食4个月以形成 动脉粥样硬化，再以降脂药物干预，观察动脉粥样斑块局部的物质变化。结果发现降低血 脂特别是sLDL，可以影响病变的性质而改变斑块的稳定性。研究发现金属蛋白酶(MMP)过度 表达可以减少动脉粥样硬化斑块纤维帽等胶原而使斑块破裂，降低血脂特别是sLDL，可使 MMP活性下降，允许动脉细胞外基质巨大分子如组织间隙的胶原积累，通过限制刺激基因转 录或通过减少这些酶的活性和分泌，减少降解基质的蛋白酶表达，从而可以减少冠脉事件 的死亡率。 血浆中与含 apo B 脂蛋白结合的磷脂酶A2（PLA2）称之为脂蛋白相关PLA2（Lp- PLA2），主要存在于sLDL中，因此常将此作为sLDL的标志物，不少研究已发现Lp-PLA2亦可 作为AS的预测物 76，92-98 。Zeljkovic等 104最近研究109例CHD（动脉狭窄50%）与102例 健康对照，发现单独测LDL-C和 Lp（a）均不能将二组区分开来，如单独测定sLDL和 apo（a），二组统计学处理差异有显著意义，如联合分析sLDL与 apo（a），则对CHD诊断 的阳性率更高。Pauciullo等 106发现在135例家属性结合性高脂血症（familial combined hyperlipidemia, FCHL）与正常对照组相比，sLDL明显升高，77%的患者大于正常参考区间， 而与代谢综合症无关，与冠心病的病史或家属史相关，而与年龄、性别、TC、apo B、代谢 状态无关，说明了sLDL与FCHL高度相关，与CHD的病史相关。 2002年美国胆固醇教育计划成人教育组第三次指南（NCEP-ATP III）将sLDL作为冠心 病新的重要危险因素，并推荐对这种脂蛋白进行检测 48。 Ogita等 47观察到sLDL-C每天有节律性变化，在早餐前最高，在每次餐后降低，晚餐 后最低，然后在晚间逐渐升高。Austin等 6发现在正常男性sLDL占LDL的30%50%，而在青 年男性（20岁）和绝经期前女性显著降低 51，为5%10%，绝经期后妇女为15%25% 52。 我们用肝素-氯化镁法测得正常男性和女性sLDL-C分别为 8 0.570.27mmol/L、0.400.32mmol/L,性别间差异显著。用微流控芯片电泳测得正常男性 和女性sLDL-C分别为0.400.11mmol/L、0.370.17 mmol/L。生化测定结果约高于微流控 芯片电泳法，是否与lLDL沉淀不完全有关或方法的特异性不强，有关研究正在进行中。用 微流控芯片电泳分析，冠心病患者sLDL-C为0.930.15mmol/L,与正常对照比较差异有显著 意义，并显示与血清三酰甘油呈正相关，与HDL-C呈负相关。 2与高三酰甘油血症的关系 如前所叙富含TG的脂蛋白的代谢是生成sLDL的主要决定因素，一般情况下空腹TG升高， sLDL亦升高，但近几年发现即使空腹TG正常，而餐后TG升高者，sLDL升高。 99-103 3. 与糖尿病的关系 sLDL 与视黄醇结合蛋白 4(RBP4)存在一定关系,这二者均与胰岛素的抵抗有关,作者认 为 RBP4 是影响年轻成年妇女主要因素之一,对 sLDL 的代谢起着一定作用 107。 六、食物与药物对 sLDL 的影响 Utarwuthipong 等 105研究了使用大豆油、稻糠油和棕榈油对 sLDL 的影响，在严格控 制饮食的情况下，连续服用 10 星期后，服用大豆和稻糠油的 TC 与 LDL-C 下降，服用大豆 油可明显使 sLDL 下降，而其他二种食用油不明显，因此作者推荐食用大豆油。 参考文献 1.Krauss, RM et a1J Lipid Res 1982；23：97-104. 2.Fisher WR. 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