mhc相合造血干细胞移植后cgvhd小鼠模型建立

MHC 相合造血干细胞移植后 cGVHD 小鼠模型建立 李海霞 1, 王 婵 2, 吴秉毅 3, 张传仓 2 (审校 ), 封志纯 2 ( 1. 北京 军区总医院附属八一儿童医院 山西医科大学在读硕士研究生 ; 2. 北 京军区总医院附属八一儿童医院; 3. 南方医科大学附属珠江医院, 指 导老师 ) 摘 要: 目的 建立主要组织相容性复合物 (MHC) 相合造 血干细胞移植的慢性移植物抗宿主病 ( Chronic graft verse host disease, cGVHD) 小鼠模型, 为进一步研究 cGVHD 的发病机制及防 治方法构建平台。方法 以雄性 DBA /2H - 2d 为供 鼠, 雌性 BABL /CH - 2d 为受鼠, 接受 60 Co 515Gy 全身照射后分成 3 组, 4 6h 内 完成移植。A 组输注 RPM I1640 培养液、 B 组输注 5 107 个脾 细胞 /只、 C 组输注 10 107 个脾细胞 /只。 （脾细胞移植作用？） 观察指标为: 造血重建时间; 移植物植入情况; 各组 小鼠 cGVH D 的临床表现; 各组的病理学改变及成模率。结果 造血重 建: C 组较 A、 B 组造血重建延迟, 差异有统计 学意义。 植入情 况检测: 移植组小鼠均为供、受者共存的混合嵌合体。 cGVHD 的 临床表现及评分: A 组均未出现 cGVHD 的临床表现, B、C 组小鼠 出现 cGVHD 的临床表现, 两组的临床评分有统计学差异 ( P = 01016)。病理改变及 成模率: A 组病理学未见明显异常; B、 C 两 组出现 cGVHD 的病理学改变, 但是两组评分无统计学差异 ( P = 01410); 根 据病理学评分判断各组小鼠的成模率分别为 0% 、 60% 、 80% 。结论 60 Co 515Gy 全身照射后输注 5 107 个脾细胞可 诱导 出 cGVH D 小鼠模型 , 且配型方式与临床 MH C 相合造血干 细胞移植类似, 可以作为研究 MH C 相合造血干细胞移植后 cGVHD 的理想模型。 关键词: MHC 相合 ; 慢性移植物抗宿主病 ( cGVHD); 小鼠模型 中图分类号: R - 33 文献标识码: A 文章编 号: 1006- 9534 ( 2010) 07- 0026- 05 异基因造血干细胞移植是目前 根治恶性血液系统疾病, 以及某些遗传性疾病、免疫缺陷病、实体 瘤的最有效方法之 一。但是慢移植物抗宿主病 ( cGVHD)是异基因 造血干细胞 移植最主要的并发症和导致移植失败及患者死亡的重要 原 因之一, 严重影响了异基因造血干细胞移植治疗的疗效。近 年 来, 尽管移植方式不断改进和新的免疫抑制剂的不断研 发, cGVHD 仍未得到理想的控制, 究其原因是对 cGVH D 的 发病机制了解甚少。 因而, 建立接近人类 cGVHD 病理机制 及临床表现的动物模型, 对 cGVHD 的研究具有重要意义。 本实验受鼠减低剂量预处理后, 输 注 MHC 相合、次要组织相 容性抗原 (m HiA s)不相合的供鼠脾细 胞, 诱导出类似人类 cGVHD 表现的小鼠模型, 为进一步研究 cGVH D 的发病机制 及防治途径提供平台。 （背景） 材料与方法 1. 实验动物: 供鼠为雄性 DBA /2H - 2d 小鼠, 受鼠为雌性 BALB /CH - 2d 小鼠, 均为 8- 12 周, SPF 级, 由北京市维通利华 动物实验 公司提供。饲养于北京大学医学部动物实验中心 SPF 级动物房内, 给予无菌食物、高压消毒无菌水、辐照消毒 垫料。 2. 主要试剂及 仪器: RPM I1640(无血清 )溶液, 苔盼蓝染 液, 秋水仙素, 固定液 (甲醇 B 冰醋酸 = 3B1), 倒置显微镜, 超 净工作台, 血细胞计数板, 200 目不锈钢筛网, 低温高速离心 机, 60 Co 放疗机 (由军事医学科 学院辐照研究所提供 )。 3. 实验方法: ( 1) 受鼠预处理、分组: 受 鼠 BABL/CH - 2d 移植前 5d 开 始饮用含庆大霉素 (320 mg /L)和红 霉素 ( 250 mg/L)的饮用 水, 直至移植后 2 周。移植当天采用 60Co C 射线全身照射进 行预处理, 照射剂量为 5. 5Gy（抑制免疫） 。预 处理后采用随机字表法分 通讯作者: 封志纯 组, 如下: A 组单纯照射组 ( n= 10, 经尾静脉输注 0. 5m lRP- M I1640 培养液 ), B 组 ( n= 10, 经尾静脉输注 5 107 个脾细 胞 ), C 组 ( n= 10, 经尾静脉输注 10 10 7 个脾细胞 )。各组 于照射后 4 6 h 内完成移植。 ( 2) 供鼠脾细胞制备 : 将 DBA /2 供鼠颈椎脱 臼处死, 无 菌条件下解剖取脾, 置 200 目筛网研磨、过滤, 制成单 细胞悬 液, 用红细胞裂解液裂解红细胞后, 调节细胞浓度为 10 107 /m l、20 107 /m l 备用。 ( 3) 外周血染色体制备: 小鼠腹腔注 射秋水仙素 3 4Lg /g, 5h 后以眼球摘除法, 留取 0. 5 1m l 全血 (加 肝素抗 凝 ), 0. 075mol/LKC l 溶液低渗处理 , 反复 3 次固定后滴片, G iem sa 染色 10m in, 室温晾干后镜检。 4. 观察指标 ( 1) 造血重 建观察: 于 - 1、 7、14、21、28 天分别检测受鼠 外周血白细胞情 况, 监测造血功能重建时间; ( 2) 移植物植入检测: 实验终点 B、 C 组各选取 2 只小鼠 制备外周血单个核细胞染色体标本, 计数 20 个 分裂相, 检测 Y 染色体的阳性率。 ( 3) cGVHD 的临床评分: 脾细 胞移植后每天观察小鼠一 般状态, 包括体重、被毛、姿势等, 移植 14 天后每 3 天进行一 次临床评分, 评分标准参照国内外相关文献 1- 5 的进行评 分, 部分内容根据本实验略作修改。评分标准见表 1 5 。 表 1 慢性 GVHD 的临床评分标准 得分 0 分 1 分 2 分 3 分 脱毛 无 2cm2 体重减 轻 无或减轻 2% 2% 8% 8% 弓背体态 无 不影响运动 影响运动 注: ( l) 耳朵、尾巴、脚掌每处脱皮或结痂记 0. 3 分, 皮肤临床表 现最低得 0 分, 最高得 3. 9 分。 ( 2)皮肤得分超过 0. 6 分视为发生 GVHD; 即使症状消退、小鼠自然死亡或人为因素造成死亡也视为 发 生 GVHD; 小鼠无症状死亡视为无 GVHD。 #26# 中国优生与遗传杂志 2010 年第 18 卷第 7 期 ( 4) 慢性移植物抗宿主病的病理评分: 濒死小鼠或实验 终点颈椎脱 位处死小鼠, 解剖, 取皮肤 (肩胛部或病变部位 )、 肝脏、小肠、 肾脏等器官, 经 10% 福尔马林固定、脱水、浸蜡、 包埋、切片、HE 染色等制备病理切片, 镜下观察并评分。评 分标 准见表 2。 表 2 慢性 GVHD 的病理评分标准 1, 5 得分 0 分 1 分 2 分 3 分 4 分 皮肤 表皮 正常 轻度增生 明显增生 真皮 正常 轻度改变伴少量胶 原沉积 大量胶原沉积 炎症 无 局灶性浸润 广泛浸润 皮下脂肪 正 常 脂肪细胞减少 严重萎缩 毛囊 (个 /mm) 5 1 5 10 107 个脾细胞可能出现急性移植物 抗宿 主病 ( aGVHD)表现 11 。我们建立的小鼠模型符合 B il-l ingham 提出 GVHD 发生的三个条件 : ( 1)移植物中必须有足 够的免疫活性 细胞; ( 2)受者必须表达有不同于供者的抗原; ( 3)受者无法发挥对移 植物的有效排斥反应 12 。 本模型小鼠的临床表现为体重下降、 脱毛等, 组织病理 学改变以皮肤、肝脏、肾脏等病变为主, 这与人 类 cGVHD 的 临床表现相似。模型小鼠的发病时间多集中在移植后 30 45 天, 与国外文献报道 MH C 相合 (m HiAs 不相合 )的模型的 发病时间相一致 1。实验中, 我们设立单纯照射组, 一方面 用来 排除照射引起体重下降、皱毛、食欲下降等的效应, 另一 方面单纯 照射组 4 周后血象逐渐恢复正常 , 说明预处理为非 清髓性。非清髓 性预处理是模拟临床减低预处理强度, 增加 了小鼠的耐受性, 降低 实验小鼠的死亡率, 更有利于实验的 观察和后续干预实验的进行。 实验 C 组输注脾细胞数量是 B 组的 2 倍 , 体重下降时间及发病时 间均较 B 组提前, 其临 床评分较 B 组严重 , 结果表明 cGVHD 的 发病情况及疾病的 严重程度与供者来源的淋巴细胞数量相关, 这与 国外 H ar-i das 11的报道结果也是相符合的。 C 组小鼠的生存期 相对 短, 似乎与 cGVHD 不相符, 但是病程中 C 组小鼠均未出现体 重急剧下降、严重腹泻等 aGVHD 表现, 移植后逐渐出现头背 部脱 毛, 随着时间的推移, 脱毛范围逐渐扩大, 肝脏病理学改 变出现大 面积汇管区淋巴细胞浸润, 胆管坏死等 cGVHD 表 现, C 组小鼠死 亡考虑与 cGVHD 的严重程度相关。相关文 献报道: 小鼠供受体遗 传背景以及预处理条件的差异可导致 移植物抗宿主疾病类型以及靶 器官表现的差异 13 , 供者 DBA /2 缺少适当数量的 CD8+ T 细胞 和细胞毒性（致 aGVHD） T (CTL)细 胞可能是引起 cGVHD 的决 定因素 14 。 B、 C 组小鼠均可诱导出 cGVH D 表现, 但 C 组小鼠的疾 病程度 严重, 病情进展快 , 实验终点死亡率高 , 不适合用于 cGVHD 模型诱 导。 B 组小鼠的发病时间相对集中, 且可以出 现典型的 cGVHD 临床表现和病理学改变, 病变较稳定, 患病 率与 C 组无 统计学 差 异, 作为研 究 MHC 相匹配 移植后 cGVHD 的疾病模型较为理想, 为深入研究 cGVHD 的致病因 素及防治措施提供良好的实验工具。 本模型的优点: 更接近临床: 采用 MHC 匹配的两种小 鼠进行移 植实验, 与临床 MH C 匹配异基因移植方式相类似; 模拟临床减低 强度预处理的非清髓性照射, 通过淋巴细胞回 输诱导出 cGVHD 疾 病的小鼠模型。 成模时间相对短 , 临 床症状稳定: 模型组小鼠的 发病时间多集中在脾细胞输注后 30 45 天内, 症状延续到实验终点。 模型动物的选择: CD8+ T 细胞是 aGVHD 的 效应细胞, CD4+ T 细 胞主要与 cGVHD 有关, V ia14 等研究 DBA /2 小鼠与 C57BL /6 小鼠脾 细胞相比, CD8+ T 细胞少 2 倍, 因此选择 DBA /2 小鼠作 为供 鼠较 C57BL/6 小鼠作为供鼠, 更易发生 cGVHD。 本实验的 不足之处是未建立本模型的评分系统, 在临床 评分及病理评分方面 存在一定的局限型, 在今后的研究中模 型评分系统尚需不断改进。 参 考 文 献 1Y aron Ilan, et a.l Induction of oral tolerance in splenocyte recipients toward pretransplant antigens ameliorates chronic graft versus host dis- ease in a murinemodel J. J Blood, 2000 Jun 1, 95( 11): 3613- 9. 2Anderson BE, M cN iff JM, Jain D, et a.l D istinct roles for donor- and host- derived antigen- presenting cells and costimulatory molecules in murine chronic graft- versus- host disease: requirements depend on target organ J. Blood, 2005, 105( 5): 2227- 2234. 3M atte CC, L iu J, Cormier J, et a.l DonorAPCs are required formax-i malGVHD but not forGVL J. NatM ed, 2004, 10( 9): 987- 992. 4Anderson BE, M cN iff JM, M atte C, et a.l Recipient CD4+ T cells that survive irradiation regulate chronic graft- versus- host disease J. Blood, 2004, 104( 5): 1565- 1573. 5吴远彬, 等. 单倍体相合造血干 细胞移植后慢性移植物抗宿主病 小鼠模型的建立及其评价 J. 中 国组织工程研究与临床康复, 2008, 12( 12): 2326- 2330. 6 Sullivan KM. Graft- vs- host disease. In: Blume KG, Forman SJ, Ap- pelbaum FR, eds. ThomascHematopoietic Cell Transplantation. M a-l den, MAM . Blackwell Science, 2004. 635- 664. 7 Lee SJ, Vogelsang G, FlowersME. Chronic graftversus- host disease J. Biol BloodM arrow T ransplan,t 2003, 9: 215- 233. 8 Lee SJ. N ew approaches for preventing and treating chronic graft- versus- host disease J. Blood, 2005, 105: 4200- 4206. 9 Farag SS. Chronic graft- versus- host disease: where do we go from here? J. BoneM arrow T ransplan,t 2004, 33: 569- 577. 10宋阿霞, 等. 慢性移植物抗宿主病发病机制的研究进展 J. 国 际输血及血 液学杂志, 2008, 31( 4): 347- 350. 11HaridasV, K amat RS. Antigen presenting cells( APC) of mice w ith chronic graft- versus- host disease( GVHD ) cause excessive activa- tion- induced death of T helper cells J. Clin Exp mImuno,l 1997, 110( 3): 454- 463. (下转第 38 页 ) #29#中国优生与遗传杂志 2010 年第 18 卷第 7 期 表 1 28 例异常染色体异常结果 类别 核型 例数 常染色体三体 10 例( 37104% ) 47, XX, + 21 2 47, XY, + 21 1 47, XX, + 16 2 47, XX, + 22 1 47, XY, + 18 1 47, XX, + 15 1 47, XX, + 22 1 47, XX, + 9 1 性染色体单体 6 例 ( 22122% ) 45, XO 6 三倍体 6 例 ( 22122% ) 69, XXX 4 69, XXY 2 嵌合体 2 例 ( 11111% ) 69, XXY /48, XY, + 21, + 22 1 47, XY, + 21 /46, XY 1 四倍体 1 例 ( 3170% ) 92, XXXX 1 双重三体 1 例 ( 3170% ) 48, XX, + 21, + 18 1 性染色体异常 1 例 ( 3170% ) 47, XXY ( FISH 法 ) 1 结构异常 1 例 ( 3170% ) 45, XO /46, X i(X q) 1 表 2 28 例异常染色体种类情况 类别 例数 比例% 45, XO 6 21142 三倍体 6 21142 21- 三体 3 10171 16- 三体 2 7114 嵌合体 2 7114 9- 三体 1 3157 15- 三体 1 3157 18- 三体 1 3157 22- 三体 1 3157 47, XXY ( FISH 法 ) 1 3157 四倍体 1 3157 双重三体 1 3157 结构异常 1 3157 型分析, 同时对培养失败标本以 FISH 进行诊断。结果显示 在 85 例自然流产绒毛染色体中, 异常核型 28 例, 检出率为 32194% , 与 研究发现的早期难免流产中 3015% - 5419% 的 流产儿具有异常染 色体的文献报道基本符合 2 。 通过结果分析, 异常染色体 28 例 核型中, 染色体数目异 常 27 例, 占 96142% , 结构异常 1 例, 占 3157% 。说明染色体 异常是导致早期自然流产的最重要原因 , 而染 色体的异常主 要还是数目的异常。具体核型分布见表 1。结果显示 三体型 是最常见的, 其中又以 21、16 三体居多, 这与以往的研究 接 近 3 。但我们同时又发现, 在异常结果中 , 性染色体单体 ( 45, XO)占的比例很大 (表 2), 共 6 例, 占 21142% 。由此我们推 测, 性染色体单体 (45, XO)很少能存活到怀孕的中晚期 , 更容 易发生早 期流产。这一推断还需得到更多的资料的支持。 2. 荧光原位杂交 (FISH )是应用特殊荧光素标记的染色 体 DNA 探 针, 对未培养的绒毛组织进行原位杂交来诊断染 色体异常。 1997 年 Jobanputra 等和 2003 年 Kucheria 等 4 又 应用间期 FISH 来 诊断新鲜的流产组织, 使用了两组探针, 能 辨认出染色体 13, 15, 16, 18, 21, 22, X 和 Y。研究发现应用 上述探针能辨认出自然流产组织 中 80% 的染色体异常 , 证实 其为快速有效的方法, 克服了细胞培 养费时费力等问题, 母 细胞污染的影响小。 FISH 允许分析大量的 间期核, 因此也 是鉴别嵌合体的有效方法。本研究对培养失败的绒 毛组织 进行荧光原位杂交很好的解决了细胞培养所存在的失败率 的问题。给病人及临床提供了有效的依据。 3. 目前国内外最为常 规的针对自然流产的检查是对夫 妻双方进行外周血染色体的核型分 析 ( G 显带法 )。据研究 表明, 外周血染色体核型分析只能为 214% 510% 5, 6 的自 然流产患者找到病因。因此, 开展绒毛组织的染 色体检查是 相当有意义的。 4. 综上所述, 胚胎染色体异常是自然 流产的重要病因, 如果能对自然流产绒毛进行常规染色体检查, 将对 了解本次 流产的原因, 能及时作出判断, 并有针对性地指导下一次 受 孕。同时, 由于常规染色体检查方法还存在着不足, FISH 只 能 诊断染色体数目异常, 不能检测结构重排, 并且对陈旧组 织的诊断 中对探针的要求高, 另外, 制备探针需了解待测区 域, 某些基因区 域的特异探针尚不能获得, 使 FISH 的应用存 在一定的局限。我们 还需要致力于新的检测技术的研发, 如 比较基因组杂交 (CGH )、 光谱核型分析 ( SKY)等, 以期对自 然流产的研究有更大的突破。 参 考 文 献 1M acklonNS, Geraedts JP, FauserBC. Conception to ongoing pregnan- cy the black boxc of early pregnancy loss J. Hum R eprod, 2002, 8 ( 4): 333- 43. 2顾世光, 高尔生, 赵鹏飞, 主编. 生殖健康 M . 北京: 人民卫生出 版社, 1998174- 75. 3 Carrera M. Screening prenatal de aneuploid as: QF - PCR vs FISH J. Prog D iag Prenat, 2001, 13: 262- 6. 4Kucheria K, Jobanputra V, TawlarR, et a.l Human mo lec