pcr实验技术总结

增加 PCR 的特异性： 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的 primer 要符合 下面的 一些条件 a. 足够长 ,18-24bp,以保证特异性 .当然不是说越长越好,太长的 primer 同样会降低特异性,并且降 低产量 b. GC% 40%60% c. 5端和中间序列要多 GC,以增加稳定性 d. 避免 3端 GC rich, 最后 3 个 BASE 不要有 GC,或者最后 5 个有 3 个不要是 GC (有人说：3 端最好是 GC/CG/CC/GG。) e. 避免 3端的互补 , 否则容易造成 DIMER f. 避免 3端的错配 g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到 5端, 在算 Tm 值时不算,但在检测互补和二级结构 是要加上它们 i. 使用兼并 primer 时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性 ,不要在 3端使用兼并 primer,并 使用 较高的 primer 浓度(1uM-3uM) j. 最好学会使用一种 design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al. * primer 的另一个重要参数是熔解温度（Tm ） 。这是当 50的 primer 和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度.Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低， 以保证 primer 同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温 度从 55到 70。退火温度一般设定比 primer 的 Tm 低 5。 设定 Tm 有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 18 碱基的 primer。 有的是根据 GC 含量估算 Tm。确定 primerTm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一 级结构和 相邻碱基的特性预测 primer 的杂交稳定性。大部分计算器程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及 primer 序列的不同，Tm 会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的 Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。 开始低于估算的 Tm5，以 2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少 primer 二 聚体和非特异性产物的形成。 为获得最佳结果，两个 primer 应具有近似的 Tm 值。primer 对的 Tm 差异如果超过 5，就会 primer 在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个 primerTm 不同，将退 火温度设定为比最低的 Tm 低 5 或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷 贝。 2. stability of primers 定制 primer 的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。 primer 产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制 primer 以干粉形式运输。最好在 TE 重 溶 primer，使其最终浓度为 100M。TE 比去离子水好，因为水的 pH 经常偏酸，会引起寡核甘 的水解。 primer 的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的 primer 储存在-20。以大于 10M 浓度溶于 TE 的 primer 在 -20可以稳定保存 6 个月，但在室温（15到 30）仅能保 存不到 1 周。干粉 primer 可以在-20保存至少 1 年，在室温（15到 30）最多可以保存 2 个月。1.PCR 产物的电泳检测时间 一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致消失。 2.假阴性，不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有 Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化 除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性 不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过 程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致 假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不 理 想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度 低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要 看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮 度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合 成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高 浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设 计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异 性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul 、50ul。或 100ul，应用多 大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做 大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现 假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模 板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内 的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺 失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 3.假阳性 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增 时， 扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设 计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污 染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加 样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用 离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射， 以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源 性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。 4.出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与 非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合 形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数 过多有关。其次是 酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也 会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法 (93变性，65左右退火与延伸)。 5.出现片状拖带或涂抹带 PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差， dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量， 或调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，减少循 环次数克隆 PCR 产物 PCR 反应体系与反应条件 标准的 PCR 反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10100pmol 模板 DNA 0.12ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补 的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物， 利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。 引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二 聚体，产生非特异的扩增条带。 引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配 对而导致 PCR 失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分 析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓 度 0.11umol 或 10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错 配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶， 另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状， 如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会 使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50200umol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相 等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度 过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜 上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白 质结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚 与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用 于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染 色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白 酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各 种 dNTP 浓度为 200umol/L 时， Mg2+浓度为 1.52.0mmol/L 为宜。Mg2+ 浓度过高，反应特异 性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR 反应条件的选择 PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反 应中采用三温度点法，双链 DNA 在 9095变性，再迅速冷却至 40 60，引物退火并结 合到靶序列上，然后快速升温至 7075，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延 伸。对于较短靶基因(长度为 100300bp 时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸 温度可合二为一，一般采用 94变性，65左右退火与延伸(此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催 化活性)。 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下， 9394min 足以使模板 DNA 变性，若低于 93则需延长时间，但温度不能过高，因为高 温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失 败。 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷 却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之 间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱 基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物，55为 选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm 值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm 值-(510) 在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性： 7080 150 核苷酸/S/酶分子 70 60 核苷酸/S/酶分子 55 24 核苷酸/S/酶分子 高于 90时， DNA 合成几乎不能进行。 PCR 反应的延伸温度一般选择在 7075之间，常用温度为 72，过高的延伸温度不利 于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够 的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长 些。41 TaqDNA 聚合酶 在早期进行的 PCR 反应中，使用的是大肠杆菌 DNA 聚合酶 1 的大片段， ，即 Klenow 片段。也 曾有人用噬菌体 T4 DNA 聚合酶。这两种酶的共同弱点是对热不稳定性，DNA 合成反应只能在 370C 进行。PCR 时每一循环的解链温度都在 90C 以上进行，故在每两个循环之间要加入新的 DNA 聚合酶，使得整过程整个实验过程很繁琐和昂贵。同时在 370C，引物与 DNA 模板之间会 发生分子非特异性结合，最终导致很多非特异性 DNA 片段的扩增。 Taq 酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是 720C（75-80） ，连续保温 30 分钟仍具有相当的 活性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化 DNA 合成的能力，一次加酶即可满足 PCR 操 作过程自动化的实现。 （1） TaqDNA 聚合酶的热稳定性及最适延伸温度 相对分子质量为 94000 的 TaqDNA 聚合酶的酶活性较高，大约为 200000Umg，在合成时有一个 较高的最适温度 75-80C，转换数 Kcat 接近 150nt/(s酶分子)。这种活性有明显的温度依 赖性。TaqDNA 聚合酶虽然在 90C 以上合成 DNA 的能力有限，但高温时仍比较稳定。有人试 验证明在 92.5C,95C,和 97.5C 时， PCR 混合物中的 TaqDNA 聚合酶分别经 130 分钟、40 分钟和 5-6 分钟后仍可保持 50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个 PCR 预备试验中，每次循 环时上限温度为 95C（试管内）处理 20 秒，则循环 50 次后 TaqDNA 聚合酶仍可保持 65%的活 性，能够保证实验的需要。 TaqDNA 聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在 75-80C 时，dNTP 的掺入速度为 35-100nt/(酶分子), 最长延伸长度 7。6kb，如对 M13 上的富含 GC 的 30-me 引物，该酶 在 70C 的延伸率高于 60nt/(酶分子), 在 55C 仍有较高的延伸活性， 22C 和 37C 时延伸 速度分别为 0。25 和 1。5 nt/(酶分子)。由此可见，在低温下，TaqDNA 聚合酶一表现 活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率 常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90C 以上）时，很少 DNA 合成。在体外条 件下，DNA 在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。温 度对 TaqDNA 聚合酶活性的影响见表。 由于 TaqDNA 聚合酶的最适延伸温度高达 75-80C，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非 特异性扩增产物的出现，增加了 PCR 的特异性。 42 模板 （1） 模板的纯度 一般不要求很高，不需要达到超纯。某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞 液煮沸加热，用蛋白质变性后的 DNA 溶液作模板。但 DNA 溶液中不能有影响扩增反应的物质 存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合 DNA 的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉 类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂（如 EDTA）等，会与 Mg2+络合，影响 Taq DNA 聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。 （2） 模板 DNA 的量 一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul 的反应体系中有 100ng 的模板已足够。有时，加的模板太多，会令扩增失败。这时如果对模板稀释后再加入反 应体系中，往往能获得成功。 43 dNTP dNTP 储备液必须为 PH7.0 左右,浓度一般为 2mmol/L, 分装后置-20C 保存.典型的 PCR 扩增体系 中,两种 dNTP 的终浓度为 20-200umol/L. 理论上,100ul 反应液中两种 dNTP 的浓度为 20umol/L 时,足以合成 12.5ug DNA 或合成 10pmol 400bp 的 DNA 片段. DNTP 会络合溶液中的 Mg2+, 而 且大于 200umol/L 的 dNTP 会增加 Taq DNA 聚合酶的错配率.如果 dNTP 的浓度达到 1mmol/L 时,则会抑制 Taq DNA 聚合酶活性. 44 Mg2+浓度 Taq DNA 聚合酶在合成新 DNA 链时,要求有游离的 Mg2+,因而在 PCR 系统中确定 Mg2+的最适 浓度是必要的. Mg2+浓度太低会无 PCR 产物,太高又会导致非特异的产物产生. 故常需根据各自 的实验预先试验,以确定本实验的最佳 Mg2+浓度,保证 DNA 聚合酶具有良好的活性. 通常情况下,要求反应体系中有 0.5-2.5mmol/L 的游离 Mg2+.反应内容物中, dNTP 能与 Mg2+.结 合,所含 EDTA 会与 Mg2+络合 ,高浓度的 DNA 也有干扰作用 ,都会影响 Mg2+的有效浓度. 45 PCR 系统中的其它成分 PCR 反应缓冲溶液通常用 10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3, 20C), 它是两性离子缓冲剂.此外,还有 50 mmol/L KCL, 它有利于引物与模板退火.高于 50mmol/L 的 KCL, 或 50mmol/L 的 NaCl 对 Taq DNA 聚合酶有抵制作用.明胶或血清白蛋白 (100ug/ml)及非离子去污剂,如 Tween20 等,对 Taq DNA 聚合酶起稳定作用. 46 PCR 的热循环计划 在标准反应中,将标本加热至 90-95C,使 DNA 双链变性, 再快速冷却至 40-60C 使引物退火并结 合到互补靶序列上,然后升温至 70-75C, 在 Taq DNA 聚合酶的作用下掺入单核苷酸使引物沿模 板延伸.每步时间从反应达到要求温度后计算. PCR 反应的每一个温度循环周期都是由 DNA 变 性引物退火和反应延伸 3 个步骤组成的.图中设定的反应参数是 94C 变性 1 分钟,60C 退火 1 分 钟,72C 延伸 1.5 分钟.如此周而复始,重复进行,直到扩增产物的数量满足实验需求为止 . (1) 变性温度与时间 使靶基因模板和 PCR 产物完全变性是 PCR 成败的关键.DNA 在其链分解 温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到 Tss 还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常 情况下 94-95C 变性 1 分钟就足以使模板 DNA 完全变性,更高的温度可能更为有效 (尤其是富含 C+G 的靶基因),若低于 94C,则需延长变性时间.为提高起始模板的变性效果,保存酶活性,常常在 加入 Taq 酶之前 97C 先变性 7-10 分钟,再按 94C 的变性温度进入循环方式,这对 PCR 的成功有 益处. (2) 复性温度与时间 复性温度决定着 PCR 的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在 PCR 条件下真实 Tm 值的 5C，引 物越短（12-15bp）,复性温度越低（40-45C） 。一般来说，若降低复性温度（ 37C） ，可提高坟增 产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高复性温度（56-70C） ， 虽扩增反应的特异性增加，但扩增效果下降。理想的方法是：设置一系列对照反应，以确定扩 增反应的最适复性温度。 （3）延伸温度与时间 Taq DNA 聚合酶虽能在较宽的温度范围内催化 DNA 的合成，但不合适 的温度仍可对扩增产物的特异性、产量造成影响。引物延伸温度一般为 72C（较复性温度高 10C 左右） ，延伸时间视目标 DNA 片段长短和浓度而定。在最适温度下，核苷酸的掺入率为 35-100nt/s，这也取决于缓冲体系、PH 值、盐浓度和 DNA 模板的性质等，延伸 1 分钟对长达 2kb 的扩增片段是足够的，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现，但在循环的最后一步延 伸时，为使反应完全，提高产量，可将延伸时间延长 4-10 分钟。 （4）循环数 循环数决定着扩增程度，常规 PCR 一般为 25-40 周期，在其他参数交已优化的条 件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度，其相应关系参照下表 模板 DNA 分子数 需要热循环次数 30105 25-30 15104 30-35 10103 35-40 50 40-45 循环次数太少，得不到一定的产物量；循环次数太多时，扩增反应的后期，产物积累的指数率 下降甚至不再有正确的产物生成，正常的反应几乎停止，呈现平台效应。 影响出现平台效应的因素有： A、反应试剂（dNTP 或酶）稳定性的改变； B、终产物（如焦磷酸）的抑制效应； C、产物浓度超过 10-5 时可产生重复退火，于是会降低引物延伸速率或 DNA 聚合酶的活性 D、高浓度产物 DNA 双链的解链不宝剑。平台效应时的一种重要后果是由于错误引导，在开始 时浓度不高的非特异产物会继续扩增，使结果的分析复杂化。 43 引物的要求： （1） 一般长 15-30bp，常用 20bp（理论上 420=111011 长的 DNA 片段才会有重复） 。引物过 长，扩增的效率降低。 （2） 碱基组成：C+G 占 50-60%（常规） ，尽量避免数个嘌呤和嘧啶的连续排列。 （3） 一对引物之间不能有 2 个以上的碱基互补，特别是 3末端；引物之间的碱基互补会形成 引物二聚体，引物本身应避免回文序列。 （4） 引物与模板退火的温度和所需的时间取决于引物的碱基组成、长度和溶液中引物的浓度。 合适的退火温度是低于引物本身的实际变性温度（Tm）50C。20bp 左右长度的 DNA 片段的 Tm=(G+C) 40C+(A+T) 20C。退火火温度通常在 55-720C 下进行在标准的引物浓度 （0.2umol/L）下，几秒内即可完成退火。提高退火温度可提高引物与模板结合的特异性。特别 在最初几次循环中采用严谨的退火温度，有助于 PCR 特异性扩增。如果引物中（G+C）的含量 小于 50%，退火温度应低于 550C。 （5） 100ul 的 PCR 反应液中，引物的绝对量为 10-100pmol。PCR 反应液中 2 个引物浓度不等 时，其浓度比为 50:1，称为不对称 PCR。 简并引物：由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。若 PCR 扩 增引物的核苷酸组成顺序是根据氨基酸顺序推测而来，就需合成简并引物。 嵌套引物：利用第一轮 PCR 扩增产物作为第二轮 PCR 扩增的起始材料，同时除使用第一轮的 一对特异引物外，另加 1-2 个新引物（处在同一个模板 DNA 的头两个引物之间序列）进行第二 轮扩增。通过嵌套引物扩增的产物，产生错误扩增的可能性极小，所以应用嵌套引物技术能够 使靶 DNA 序列得到有效的选择性扩增。 PCR 的的应用：基因克隆、反向 PCR、不对称 PCR、RT-PCR、基因的体外诱变和突变检测、 基因组的比较研究。 典型的 PCR 操作：（见资料一） 2. 细菌标本处理：裂解细菌的方法包括加热（950C） 、反复冻融和化学试剂裂解。细菌浓度只 要不超过 100 个/ul，裂解后可直接用于 PCR. 3. 细菌 DNA 的提取： （1） 试剂：主要包括 10mmol/LTris-Hcl(pH8.0)、10%SDS、3mol/L 醋酸钠（pH5.2） 、Rnase 液 （10mg/ml） 、冷乙醇和 70%乙醇。 （2） 方法 A、 从平板上挑取 1.5mm 的菌落移到预先装有 50ul 10mmol/LTris-Hcl 液的微量离心管中,使之 悬起. B、 加 50ul 10%SDS 液 ,600C 充分混匀,作用 10min. C、 加入 250ul 10mmol/Ltris-Hcl 液;60ul 3mol/L 的醋酸钠和 10ul RNase 液混匀,370C 作用 10min. D、 加入 1ml 冷乙醇,混匀后可见 DNA 沉淀. E、 取出 DNA 沉淀球,置另一洁净 离心管中,加入 500ul 10mmol/LTris-Hcl 溶解 DNA F、 加入 1ml 乙醇高氯酸盐试剂,置 40C 1h. G、 于 40C,12000r/min 离心 10 分钟,倾去上清,用 70%的乙醇洗沉淀一次.凉干后溶于 20ulTris- Hcl 液,PCR 中用 10-20ul. 若制备革兰氏阳性菌 DNA 标本 ,可于第一步中加入 10ul 葡萄球菌溶素(0.5mg/ml,用蒸馏水配制) 370C 作用 15 分钟后,再按上述 B-G 步操作. 4. 病毒标本 DNA 的提取：(参见预防兽医实验，PCR 技术) （1） 将 5ml 组织培养液上清或血清 500g 离心 5 分钟去除细胞。 （2） 取上清再以 10000g 离心 10 分钟，去除大颗粒物质。 （3） 小心吸取上清，以 SW50.1 转头 50000r/min 离心 45 分钟沉淀病毒颗粒，用 PBS 液平衡 离心管。 （4） 去上清，用 100-500ul 钾缓冲液（含 50mmol/L KCl、10-20 mmol/LTris-HCl、2.5 mmol/L MgCl2(pH8.3)、1%laureth12( 一种表面活性剂)、0.5%Tween20、100ug/ml 蛋白酶 K）的 TE 缓冲 溶液溶解病毒颗粒。 （5） 将溶解的病毒颗粒转移到另一洁净微量离心管中，并在 550C 保温 30-60 分钟。然后， 950C 加热灭活蛋白酶，冷却样品并离心除去所有碎片。 （6） 在 100ul PCR 反应液中，加 5-10ul 病毒核酸液。RNA 病毒可用 5-10ul 进行 cDNA 合成。 二、 4PCR 操作 41 试剂： （1） 引物：根据待扩增 DNA 不同，引物亦不同。 （2） TaqDNA 聚合酶：能耐受 93-100C 的高温。 （3） 10*PCR 缓冲液：含 500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-HCl(pH8.4, 20C)、150mmol/L MgCl 及 1mg/ml 明胶。 （4） 5mmol/L dNTP 贮备液：将 dATP、dCTP 、dGTP、dTTP 钠盐各 100mg 合并，加 3ml 灭 菌无离子水溶解，用 NaOH 调 pH 值至中性，分装每份 300ul，-20C 保存。DNTP 浓度最好用 UV 吸收法精确测定。 （5） 标本处理试剂： 4.2 操作程序： (1) 向一微量离心管中集资加入如下物质： 10*PCR 缓冲液 1/10 体积 DNA 模板 10-10 拷贝 dNTP 各 200umol/L ddHO 补至终体积（终体积 50-100ul）引物（一对人工合成寡核苷酸）各 1umol/L 混匀后，离心 15 秒使反应成分集于管底。 (2) 加石蜡 50-100ul 于反应液表面以防蒸发。置反应管于 97C 变性 7 分钟（染色体 DNA）或 5 分钟（质粒 DNA） 。 (3) 冷至延伸温度时，加入 1-5uTaqDNA 聚合酶，在此温度下作用 1 分钟。 (4) 于变性温度下（92-93 ）使模板 DNA 变性 45 秒。 (5) 在复性温度下（55C）使引物与模板杂交 45 秒。 (6) 在延伸温度下（72C）使复性的引物延伸 1 分钟。 (7) 重复（4）-（6）步 25-30 次，每次即为一个 PCR 循环。 (8) 微量琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。 3. PCR 的结果分析 （2） 琼脂糖凝胶电泳 （3） 限制性内切酶片段分析 用限制性内切酶酶解 PCR 产物，发现有特定的限制性内切酶片 段，则说明扩增的 PCR 产物是特异的，反之表明 PCR 产物在限制性位点发生了碱基突变。 （4） 核酸杂交 首先将扩增的 DNA 固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射 性标记物标记的探针杂交。阳性表明 PCR 产物是特异的。 1)克隆 PCR 产物的最优条件是什么？ 最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比 1：8 或 8：1 也行。应测定比值范围。连接用 5ul 2X 连接液,