apg-2增殖凋亡耐药论文

Apg-2 增殖凋亡耐药论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词 、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理， 不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】目的热休克蛋白 Apg-2 属 HSP70 亚家族，广泛地分布 于各种真、原核细胞，在细胞增殖和凋亡过程中发挥重要作用，但 在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）中的作用 尚不清楚。在我们的前期蛋白质组学研究中发现，H2O2 诱导空载质 粒 pMIGR1 感染的小鼠前 B 淋巴细胞（BaF3-MIGR1）和稳定表达 Bcr-Abl 融合基因的 BaF3-p210 细胞（简称 Bp210）损伤过程中， Apg-2 蛋白呈现高表达状态。过表达 Apg-2 基因可促进 Bp210 细胞 增殖，并保护其免受 H2O2 诱导的 DNA 损伤。本课题拟采用 RNA 干扰 技术,在 Bp210、Bp210-T315I（耐 STI571）及 BaF3-MIGR1 细胞内靶 向抑制 Apg-2 基因，研究其对三株细胞的影响，为 CML 治疗提供一 个新的靶点。方法（1）构建靶向沉默 Apg-2 基因的 shRNA(Hsp41- 43)质粒及作为阴性对照的无序 shRNA(HspHK)质粒，采用电穿孔方 法将 shRNA 质粒转入 BaF3-MIGR1, Bp210 和 Bp210-T315I 细胞中， 经 G418 加压培养筛选出 Apg-2 基因稳定抑制的细胞株，采用 RT- PCR 和 Western-blot 检测 Apg-2mRNA 和其蛋白的表达水平，筛选抑 制效果最佳的细胞株做后续试验。 （2）采用 Am-blue 和克隆形成实 验检测细胞增殖，流式细胞仪（FCM）分析细胞周期；瑞氏染色和 FCM 检测细胞凋亡，Western-blot 检测凋亡相关蛋白 Bax 和 Bcl-2 蛋白的表达。 （3）STI571 处理后，Am-blue 和克隆形成实验检测细 胞增殖，瑞氏染色和 FCM 检测细胞凋亡。结果（1）成功筛选出稳定 抑制 Apg-2 基因的细胞株 BaF3-MIGR1-Hspa42、Bp210-Hspa42 以及 Bp210-T315I-Hspa42，和转染无序 shRNA 的阴性对照株 BaF3- MIGR1-HspaHK、Bp210-HspaHK 以及 Bp210-T315I-HspaHK。 （2）干扰 Apg-2 表达可抑制 Bcr-Abl 阳性的 Bp210 及 Bp210-T315I 细胞增殖， 但对 BaF3-MIGR1 细胞有促增殖作用；同时能诱导三株细胞发生凋亡。 （3）Apg-2 的抑制增强了 Bp210-T315I 对 STI571 的敏感性，细胞 存活率降低，凋亡率增加。结论本研究证明干扰 Apg-2 基因的表达 可抑制 Bcr-Abl 阳性细胞 Bp210 及 Bp210-T315I 的增殖，但对 Bcr- Abl 阴性细胞 BaF3-MIGR1 的作用却与此相反。抑制 Apg-2 的表达可 通过下调 Bcl-2 的表达促进细胞凋亡，降低 Bp210-T315I 对 STI571 的耐药，为进一步研究提供了实验依据。 【关键词】RNA 干扰；Apg-2；增殖；凋亡；耐药； 【篇名】干扰 Apg-2 基因在 BaF3-p210 及 BaF3-p210-T315I 中的作用研究 【目录】干扰 Apg-2 基因在 BaF3-p210 及 BaF3-p210-T315I 中 的作用研究 符号说明 6-7 摘要 7-9 ABSTRACT 9-11 前言 12-14 第一部分 稳定抑制 Apg-2 表达的 BaF3-MIGR1、Bp210 及 Bp210-T315I 细胞株 的构建 14-21 1 实验材料与方法 14-17 2 结果 17-19 2.1 行电穿孔法成功转染 shRNA 质粒 17-18 2.2 成功筛选表达红色荧光的抗性克隆 18 2.3 RT-PCR 检测 Apg-2 mRNA 抑制效果 18-19 2.4 Western-blot 检测干扰后 Apg-2 蛋白表达 19 3 讨论 19-21 第二部分 探讨干扰 Apg-2 对 Bp210 和 Bp210- T315I 生物学活性及 Bp210-T315I 耐药的影响 21-34 1 实验材料与方法 21-24 2 结果 24-32 2.1 干扰 Apg-2 基因表达后对细胞增殖的影响 24-26 2.2 干扰 Apg-2 基因表达后对细胞凋亡的影响 26-29 2.3 干扰 Apg-2 基因表达后影响 Bp210-T315I 对 STI571 耐药的