clsi临床微生物实验室标准解读

CLSI临床微生物实验室标准解读 CLSI折点变更的官方说明 Janet Hindler, MCLS MT(ASCP) UCLA Medical Center Los Angeles, California CLSI M100-S20编者 本文由 Hindler教授提供，并允许梅里埃公司翻译及印发 Janet Hindler教授现任美国加利福尼亚州洛杉矶医学中心 (UCLA)资深专家， 华盛顿 D.C.公共健康实验室协会顾问等 职。自 1994年开始在 CLSI细菌抗生素药敏试验委员会的工作，参加制定每年 细菌药敏标准，现任 CLSI“不常见细菌和苛养菌药敏指南 “学组主席， CLSI“累积抗生素药敏试验数据指南 (M39-A3)”学组主席等多个 CLSI分委会任 职。 术语/流程 A. 似乎 CLSI和其他一些机构在使用术语“折点”和“判读标准”时候可交替 使用。在这两个词之间有区别吗？ 无区别，折点和判读标准所指的都是同一个数值。 B. 在哪里我可以找到关于 CLSI如何建立药敏折点的标准？ 在 CLSI M100-S20的第 17页有关于药敏折点建立的简要说明。关于药敏折点建 立的详细指南参见 CLSI 文件 M23- 体外敏感性试验标准和质控参数的发展 C-15682 C-1562 C. CLSI修订药敏折点的流程和程序是什么？ 简而言之，修订药敏折点包括系统性的回顾来自微生物学，药物学和临床的数 据。知名专家，赞助商(来自制药工业)和管理者参与药敏制定流程包括在每年 2次的 CLSI 药敏试验小组委员会会议的公开讨论。在制定新上市药物的初始 药敏折点时候，需要有对照临床试验数据。尽管在修订药敏折点时最好能够提 供对照临床试验数据， 这些数据在应对快速变化的细菌耐药机制和“老药”时 多数情况下是不可行的。因此，委员会必须要依赖发表的文献，专家意见和共 同商议的流程。在药敏折点修订 时必须要考虑到流行病，临床治疗和监管意见。 CLSI 分委会的会议纪要在下面的链接可以获取。 /Content/NavigationMenu/Committees/Microbiology/AS T/AST.htm 在美国 FDA和 CLSI都建立自己的药敏折点，某些时候这两个机构所设立的药敏 折点会有不同。 特别的药敏折点的变化和原由 A. 为什么要对药敏折点进行修订？ 药敏折点的修订是因为细菌耐药机制和菌群分布的变化、科学的发展使得对人 们对药物引起临床反应的机制有了更深刻的理解以及临床医生对“最佳治疗方 案”的运 用。许多临床使用的药物的药敏折点是基于 25年前的试验数据得来 的。当时的试验方法和试验标准现在来看是不可被接受的。药敏折点需要不断 的修订和更新已是 美国和欧洲微生物学家，临床医生和医政管理者所共识。例 如，2007 年通过的美国食品和药物管理法修正案(FDAAA)规定 FDA更新折点， 并且美国 FDA 已经在 2009年作出回应，为行业印发指导文件，以在系统性抗 菌药物产品和药敏试验设备中更新药敏试验信息标记。 FDAAA 2007 关于 FDAAA 2007 Guidance document 2009 关于 Guidance document 2009 B. 2010年的药敏修订都做了哪些更改？ 肠杆菌科细菌的部分头孢菌素和氨曲南的折点做了修订，列表如下： 3 / 47 Click to enlarge C. 为什么要对肠杆菌科细菌的头孢唑啉, 头孢噻肟,头孢唑肟, 头孢曲松, 头 孢他啶 和 氨曲南的药物的折点要进行修订？ 药敏折点的修订是为了在目前的用药方式和用药剂量的情况下能更好的预示抗 菌药物在对抗感染中所起的功效。从产 ESBL的细菌中所获取的知识起到了关键 的作 用。开始 CLSI推荐 ESBl的筛查和确证实验并且对于 ESBL阳性的细菌， 青霉素、头孢菌素和氨曲南的敏感性要从敏感修正为耐药，原由如下：1)观察 发 现，某些产 ESBL的菌株对上述药物的 MIC虽有升高但仍然处于敏感范围(使 用之前的折点标准) 2) 有限的临床观察发现产 ESBL菌株引起的感染，病人预 后较差。ESBL 检测的建议是针对于新耐药机制的短期解决方案。接下来，也有 发现其他的耐药机制 (如，新型 ESBLs酶和类 AmpC酶)而且同时产多种酶的耐 药菌株的比例逐渐增加使得 ESBL的检测变得更加困难。以上事实以及人们对头 孢菌素类和单环 内酰胺类的 PKPD因素对治疗效果决定作用的认识导致此次 折点的变更。折点修订后， ESBLs 筛选和确证试验将不再是决定治疗策略所必 需。当细菌同时产多种酶时，ESBL 表型的筛查和确证实验的准确性会降低(如， 当细菌同时产 ESBLs 和 AmpC酶时，检测结果会出现假阴性结果)，并且目前所 分离的绝大多数菌株都是同时产多种酶的。与耐药机制相比，菌株的 MIC和临 床治疗结局的相关性更 好。 CLSI认为，新的折点将为病人治疗提供更合理的信息并降低临床实验室工作的 不确定度和工作量。 D. 在这次的头孢菌素和氨曲南的折点修订过程中是不是对所有的头孢菌素类药 物的折点都重新进行了再评估？ 不是的，在美国不使用或不能获得的头孢菌素没有进行再评估，这些药物包括： 头孢孟多, 头孢尼西,头孢哌酮和拉氧头孢。因此，当测试这些药物对大肠杆菌、 克雷伯菌属和奇异变形杆菌的抗菌活性时，需要进行 ESBLs筛选和确证试验。 对于 ESBL 确证试验阳性的菌株，这些药物的敏感结果均需报告为耐药。耐药 机制相比，菌株的 MIC和临床治疗结局的相关性更好。 E. 为什么没有对头霉素, 头孢西丁和头孢替坦的折点进行修订？ 用目前的药敏折点标准对头孢西丁进行了评估，没有修订头孢西丁的药敏折点。 PK-PD药物评估显示，在给定的剂量下药物的浓度是在目标范围之内的。头孢 替 坦的药敏折点没有进行修订是因为没有足够的数据来支持。头霉素类不被 ESBLs水解并且头霉素的敏感结果不会由于 ESBLs的确证试验阳性而改为耐药。 F. 为什么没有对头孢吡肟和头孢呋辛(肠外)的折点进行修订？ 没有对头孢吡肟的折点进行修订是基于目前的临床试验数据和 PK-PD评估。临 床试验证实了对于产 ESBL但头孢吡肟敏感(MIC8 g/ml)的菌株感染的病人， 头孢吡肟是有疗效的。PK- PD 评价结果表明，头孢吡肟日剂量超过 3克(即每 8小时 1克或每 12小时 2克)可以使头孢吡肟的药物浓度达到评估折点时所使 用的目的暴露标准。数据回顾显 示，没有必要修订现行的头孢呋辛(注射)折点， 但需注意现行折点只适用于每 8小时 1.5克或更高的给药剂量。 G. 为什么没有头孢唑啉纸片扩散法的药敏折点？ 纸片扩散法抑菌圈的大小和修订后头孢唑啉 MIC 的折点之间的关系的研究目前 还没有完成。初步的研究并没有确立明确的抑菌圈直径折点，并且头孢唑啉的 纸片扩散法试验可能需要使用一种改变含药剂量的新型纸片。 H.为什么头孢噻吩移至肠杆菌科细菌测试/报告的 U组？ 头孢噻吩的注射用法在美国已不再使用。由于与肠杆菌科相关，口服头孢噻吩 主要用于尿路感染的治疗。头孢噻吩的敏感性结果可代表其他几种 FDA批准用 于治疗尿路感染的口服药物的活性，包括头孢羟氨苄，头孢泊肟，头孢氨苄和 氯碳头孢。 I. 对于非肠杆菌科类细菌头孢菌素和氨曲南的折点是否有改变？ 没有改变，但是非肠杆菌科细菌头孢菌素和氨曲南的折点目前正处于评估阶段， 在将来可能会进行修订。 实验室检测和报告-通则 5 / 47 A. 是否有必要通告临床大夫，药剂师，感染科医生，感染控制专员，和其他 P 2) 有一套体系可使用修订的折点来解释 MIC结果(例如，能够修改软件系统中 的折点或手工解释药敏结果) 3) 需进行实验室内验证。 此策略也在 CLSI的 M100-S20第 18也指出:“通过与传染病医生和药房部门以 及治疗和药剂业及感染控制委员会的医务人员进行讨论，临床实验室可推 行修 订的折点“。对于纸片扩散法，一旦 CLSI在 M100文件中公布了其新的折点， 临床实验室即可采用。如果药敏系统包含的抗菌药物浓度足以使用 CLSI 折点 解释药物敏感性，那么，实验室经过适当的验证后即可使用 CLSI折点解释和报 告药敏结果。 F. 实验室如何对那些包括低浓度头孢唑啉, 头孢噻肟, 头孢曲松, 头孢克肟, 头孢他啶和(或)氨曲南的 FDA认可药敏板进行新折点的验证？ 注：涉及的药敏板包括 FDA认可的使用旧折点但浓度涉及涵盖了修订后药敏折 点的药敏板。 没有推荐的标准方法用于做这样的验证实验，每个实验室的主任都必须确定哪 些对于他/她的实验室是可行的。做这样的确证是为了明确有可接受的“组间一 致 性”。这就意味着药敏仪器测定值通过修订后的折点得出的 S，I 和 R的结 果和使用 CLSI的参比方法纸片扩散法，肉汤稀释法和琼脂稀释法得出的结果有 一致 性。通过下表的 1和 2的方法是最保守的获取 S，I 和 R结果的方法。然 而，对于多数的实验室测试，实验室主任最终对于有效性是负有责任的，并且 能够决定是否 别的方法是可行的。对于还没有 FDA认可的使用新折点的商业药 敏系统。 选 项 参考方法 说明 1 纸片扩散 法 在重新评估目前的药敏折点，修订后的纸片扩散法 S，I 和 R 的结 果和使用参考方法微量肉汤稀释法和修订后的药敏折点得出的结 果相关联，如 CLSIM23-A2 中所描述的。 2 CLSI 肉 汤或琼脂 稀释法 多数情况下，需要将菌株送到参比实验室使用 CLSIM07-A8 的肉 汤或琼脂稀释法来进行实验。 3 其他 对于实验室主任个人来说需要决定使用 FDA 批准的商业化的 MIC 实验可以用来做为参比方法，只要其能够提供所需要的药物浓度。 如果使用测试系统和纸片扩撒法所得出的结果有相矛盾，则需要使用 CLSI的肉 汤稀释法和琼脂稀释法的 结果为最后的结果。 注：尽管 CLIA不专门涉及药敏系统的验证。实验室也要明白 CLIA对于诊断试 验和验证的要求。 CLIA regulations (CLIA 493.1253): /clia/regs/toc.aspx 9 / 47 和 /CLIA/downloads/apcsubk1.pdf G. 为什么在使用修订后的药敏折点后不需要进行 MIC结果的确认？ 如果使用一个 FDA批准的包含了低浓度药物药敏组合的板条。生产厂家已经证 明了从其测试系统所得到的 MIC结果和 CLSI推荐的琼脂稀释法和肉汤稀释法所 获得的结果是有可比性的。 H. 在验证实验中要做多少株菌株以及需要哪些菌株？ 没有标准的试验方法可以推荐，实验室主任需要自己决定需要做什么实验。用 于验证的样本可能需要有 30株细菌，包括：5 株 ESBL确证实验为阳性的菌株 (可 以是肺炎克雷伯菌或大肠埃希菌)；5 株 ESBL筛查为阳性的但是 SBL确证 实验是阴性的菌(这些可能是大肠埃希菌)；从枸橼酸杆菌，肠杆菌，大肠埃希 菌， 克雷伯菌属，变形杆菌、普罗维登菌，摩根菌，沙雷菌属和其他肠杆菌科 细菌中挑选 20株(选取的菌株的 MIC在使用旧的药敏折点的情况下处于敏感的 范围内且 从给定的属中不多于 3株菌。) I. 上述的确证实验的可接受的性能水平是什么？ 没有标准化的可以推荐。在多数杂志中发表的有大标本量的可接受的界限都可 以使用。若用于 FDA批准，生产厂家需要显示出组间一致性大于 90%并且极大 误差 (假敏感)低于 1.5%，重大误差低于 3%(假耐药)。Jorgensen 建议针对没 选择的菌株极大误差3%并且重大误差和微小误差合并7%。最近 Cumitech 认为，对于小样本量，极大误差要为 0%，重大误差要小于 5%，重大误差和微小 误差联合起来要小于 10%才是可以接受的误差率。为了计算极 大误差和主要误 差，分母分别是耐药菌株数和敏感菌株数。 CLSI23-A3描述了计算可接受误差率的另外一种方法，特别是大多数当验证菌 株的 MIC在折点附近时。小于 10%的极大误差和小于 10%的重大误差是可接受的。 这些误差的计算所使用的分母包括中介中介范围的 MIC1个稀释度范围内的菌 株数，参见 CLSI23-A3。 如果是 30株菌，且选择标准十分严格，则很难得到性能指标。实验室主任需要 在开始确定实验前决定什么是可以接受的性能。 生产商的 FDA批准文件。 J. 是否在使用修订后药敏折点时需要做额外特殊的质控实验？ 不用，当使用修订后的药敏折点时不用对质控实验的流程做任何更改。 参考文献: 略 中国医学科学院北京协和医学院 赵春江 杨启文 王辉 翻译 药敏纸片法在药敏检测中的局限-革兰阴性菌(CLSI M100-S20) 药敏纸片法在药敏检测中的局限-革兰阳性菌(CLSI M100-S20) 11 / 47 13 / 47 CLSI临床微生物实验室标准解读 CLSI 临床微生物实验室标准解读 开篇词 开篇词 陈民钧教授 北京协和医院 2009 年 6月 18日 临床微生物的常规工作包括微生物鉴定、可疑致病菌的药敏试验、耐药监测、 流行病学调查等，本栏目将就这些内容的标准化展开讨论。 就药敏试验，这里有两个问题：一是两大类药敏试验方法MIC 法和纸片扩散 法要科学化及标准化，使室内及室 间结果有可比性；一是要用现代折点来明确药敏数据、药代学及药效学、感染 的疗效结局三者内在关系，及它的的临床指导意义。世界许多发达国家都建立 了机构来 解决这两个问题。最著名的有美国临床和实验室标准化研究所 （CLSI，前称 NCCLS）的药敏试验分会及欧洲共同体药敏试验委员会 （EUCAST）。我国 卫生部 1997年规定，在未建立我国的药敏试验委员会，并 获得科学的数据前，暂时过渡地执行 CLSI 的药敏试验有关的一系列指南。在 此文件之后，经多方的努力及宣传培训，细菌室的常规药敏试验逐渐归入 CLSI 指南的轨道，取得了不小的进步，但离临床微生物全面标准化的目标仍差距甚 远。 王辉教授被邀请主持此临床微生物标准化栏目，选择为几年来世界药敏试验标 准化及建立现代折点方面的重大变革撰文。今后她还会就临床微生物各项任务 的标准化 撰文讨论。王辉教授现任职于中国医学科学院北京协和医院检验科细 菌室，并于 2009年 4月被聘为 CLSI药敏试验分会顾问委员会顾问。CLSI 近年 来正积极面向国际化发展，他们邀请王辉进入 CLSI，表明重视中国临床微生物 的工作进步与发展，热望中国临床微生物工作更快更完善地纳入世界标准化范 围。 我很高兴梅里埃中国公司设置此栏目来促进中国临床微生物标准化工作的发展。 CLSI临床微生物实验室标准解读 葡萄球菌 15 / 47 CLSI 临床微生物实验室标准解读 第一辑 2009年 CLSI (M100-S19)中葡萄球菌属药敏更新部分 中国医学科学院北京协和医院 王辉 陈宏斌 2009年 CLSI在版式上的显著变化是将 K-B法和 MIC法放在同一个表格中，方 便比较。对于葡萄球菌属，主要有以下更新和变化：一是去除凝固酶 阴性葡萄 球菌苯唑西林纸片扩散法试验；二是删除了万古霉素纸片扩散法的药敏折点； 三是增加了金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的检测。 一、-内酰胺类的变化 2009年 CLSI指出在报告青霉素对葡萄球菌敏感之前，即当 MIC0.12g/ml 或抑菌圈直径29 mm，需要做可诱导的 -内酰胺酶试验。其操作如下：将分 离菌株传种至血平皿或 MH琼脂上，贴上作为诱导子的苯唑西林或头孢西丁纸片， 35孵育 16-18h，挑取抑菌圈边缘的细菌做 b-内酰胺酶试验。b-内酰胺酶试 验阳性可以预测青霉素、氨苄西林、阿莫西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛 西林和哌 拉西林耐药。 在检测 MRS时，金葡菌、路登葡萄球菌和其它凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)对苯 唑西林的折点和选取的药敏方法有所不同，具体见表 1(见下页)。在 CoNS(除 外路登葡萄球菌以外)中，由于苯唑西林纸片扩散法存在太多假“R”，所以此 法被去除，而是采用头孢西丁纸片法、苯唑西林/头孢西丁 MIC法检 测 mecA介 导的苯唑西林耐药。 对于由 CoNS(除外表皮葡萄球菌)引起的严重感染，当苯唑西林 MIC值在 0.5- 2g/mL 之间时，应当检测该菌株是否产 mecA基因或 PBP2a(图 1)。利用头孢 西丁检测 mecA 介导的苯唑西林耐药所推荐的质控菌株是金葡菌 ATCC25923- mecA阴性(抑菌圈直径 23-29mm)和金葡菌 ATCC43300-mecA阳性 (抑菌圈直径 21mm)。 图 1 CoNS*苯唑西林 MIC 结果报告策略 表 1. MRSA 的检测方法及判定折点 菌名 药物浓度 抑菌圈直径折点(mm) MIC 解释标准 (mg/mL) 备注 S I R S I R 金葡菌 1mg 苯唑西林纸 13 11-12 10 2 - 4 路登葡萄球菌 1mg 苯唑西林 - - - 2 - 4 金葡菌、路登葡萄 球菌 30mg 头孢西丁 22 - - 4 (头孢西丁) - 8 (头孢西丁) CoNS(除外路登葡 萄球菌) 1mg 苯唑西林 - - - 0.25 - 0.5 CoNS(除外路登葡 萄球菌) 30mg 头孢西丁 25 - 24 - - - 头孢西丁可以用作苯 唑西林耐药检测的替 代药。根据头孢西丁 的结果报告苯唑西林 敏感或耐药 17 / 47 二、糖肽类耐药性的检测 2009年 CLSI推荐采用 MIC法检测所有葡萄球菌对万古霉素的敏感性，去除了 纸片扩散法。这是因为纸片扩散法不能区分万古霉素敏感、中介耐药的 葡萄球 菌。图 2显示采用 Etest测定万古霉素对金葡菌的 MIC为 8mg/ml，为“I”， 而采用纸片扩散法，抑菌圈直径为 17mm，为“S”。万古霉素 纸片扩散法仅仅 对于检测含 vanA的金葡菌(VRSA)是可靠的。如果抑菌圈直径7mm，需要检测 万古霉素的 MIC值。对万古霉素 MIC值升高的金葡菌 (MIC 4mg/mL)和 CoNS(MIC8mg/mL)需要送往参考实验室进一步确证。目前的研究没有重新评估 替考拉宁纸片扩散法的折点，因此纸片扩散法能 否将替考拉宁中介、耐药的葡 萄球菌与敏感的菌株区分开来还不清楚。 2009CLSI明确指出采用含 6mg/ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂筛选万古霉素 MIC8mg/ml 的金葡菌，具体步骤如下：制备含 6mg /ml万古霉素脑心浸液 (BHI)琼脂，将待测菌株调整到 0.5麦氏单位菌悬液，用加样枪吸取 10ml菌悬 液点种到制备好的琼脂板上，或者是用菌悬液浸湿 棉签并拧干多余的液体，在 制备好的琼脂板上点种直径 10-15mm的面积，352空气孵育 24小时，1 个 菌落或薄膜生长即可推测为万古霉素敏 感性下降金葡菌。进一步的试验是用确 证的 MIC方法检测在筛选平皿上生长金葡菌对万古霉素的 MIC值。BHI 琼脂筛 选法不能稳定地检测所有万古霉素中介金 葡菌，一些万古霉素 MIC为 4mg/ml 的金葡菌不能在琼脂板上生长。推荐的质控菌株是粪肠球菌 ATCC29212(敏感) 和粪肠球菌 ATCC51299(耐药)。 异质性万古霉素中介金葡菌(hVISA)是指子代中含万古霉素 MIC值 8-16mg/ml的 细胞，大多数发生于万古霉素治疗的病人，hVISA 可能造成万 古霉素治疗失败。 采用标准的万古霉素 MIC试验，一些 hVISA的 MIC值在 1-2mg/ml之间，CLSI 中还没有检测 hVISA的特异方法。 图 2 采用 CLSI M100-S18 万古霉素纸片扩散法折点，将“I”金葡菌错误地判断为“S”(此图片 来自 Janet Hindler 教授的幻灯片) 三、达托霉素药敏试验 CLSI规定采用肉汤稀释法检测达托霉素 MIC值，使用的培养基是 CAMHB，需要 将 Ca2+调整至 50mg/mL。葡萄球菌属对达托霉素的 MIC 折点只定义敏感范围 (1mg/mL)，目前没有中介和耐药的折点。菌株 MIC值高于敏感折点被定义为 不敏感(nonsusceptible)。实验室如 果碰到达托霉素不敏感株，需要重新鉴定 菌株和检测药敏，然后送往参考实验室进一步确认。 2009年 CLSI指出纸片扩散法检测达托霉素不可靠，琼脂稀释法用于达托霉素 还没有被批准。 四金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的筛选 莫匹罗星属于 pseudomonic acid类抗生素，主要用于皮肤感染(如脓疱病)治疗 和金葡菌鼻腔定植的清除，不需要常规检测药敏，仅仅在特别必要时检测。 2009年 CLSI提出要筛选 金葡菌对莫匹罗星的高水平耐药(见表 2)。研究表明 莫匹罗星对金葡菌 MIC512mg/mL，与定植不能清除相关。虽然此文件没有定 义莫匹罗星敏感性的 具体折点，但纸片扩散法和 MIC筛选法可以鉴定莫匹罗星 MIC值512mg/mL 菌株。 表 2 金葡菌莫匹罗星高水平耐药筛选试验 纸片扩散法筛选 MIC 筛选 200mg 莫匹罗星纸片 单孔-256mg/ml MHA，35空气孵育 24h 微量肉汤稀释法，35 空气孵育 24h 无抑菌圈：高水平耐药 有抑菌圈：非高水平耐药 生长：高水平耐药 不生长：非高水平耐药 金葡菌 ATCC25923 (200mg 纸片)mupA 阴性(抑菌圈直径 29-38mm) 金葡菌 ATCC BAA1708mupA 阳性(无抑菌圈) 金葡菌 ATCC29213mupA 阴性(MIC0.06-0.5mg/mL) 粪肠球菌 ATCC29212mupA 阴性(MIC16-128mg/mL) 金葡菌 ATCCBAA1708mupA 阳性(不生长) 19 / 47 纸片扩散法在药敏检测中的局限-革兰阴性和阳性菌(CLSI M100-S19) 21 / 47 CLSI临床微生物实验室标准解读 链球菌 CLSI 临床微生物实验室标准解读 第二辑 CLSI的链球菌属药敏解读 北京协和医院 杨启文 王辉 对于链球菌属，CLSI 将药敏分为 3个部分：肺炎链球菌的药敏解读、b 溶血链 球菌的药敏解读和草绿色链球菌的药敏解读。不用的菌种 CLSI有不同的规定， 23 / 47 现对链球菌属的 CLSI药敏作逐一解读： 1. 肺炎链球菌： (1) 肺炎链球菌对青霉素和其他 b内酰胺类药物的敏感性检测 CLSI对该组合的解释标准按照感染类型和给药途径不同分为三类(表 1)，3 种 情况均有不同的折点。 对于非脑膜炎的青霉素静脉给药治疗，CLSI 认为对于青霉素 MIC2g/ml 的菌 株，肾功正常的成年人，应每次至少应用 200万单位，每四小时 给药一次（每 天 1200万单位）的方式进行治疗。对于 MIC为 4g/ml的菌株则须将剂量提高 至每天 1800-2400万单位。对于非脑脊液标本中分离 出的肺炎链球菌，需同时 使用脑膜炎和非脑膜炎的折点来报告青霉素的敏感性。 对于脑膜炎的青霉素静脉给药治疗，CLSI 认为需将青霉素用量提高至最大(如 肾功正常的成年人可使用每次 300万单位，每四小时一次的给药方式)。对于脑 脊液中分离的肺炎链球菌，仅需采用脑膜炎的折点报告青霉素的敏感性。 常规工作中可以用含 5%脱纤维羊血的 Mueller-Hinton平皿进行苯唑西林的纸 片扩散法来检测青霉素的敏感性。苯唑 西林的抑菌圈直径20mm 时，可以判定青霉素为敏感(相当于青霉素的 MIC0.06mg/ml)。但纸片扩散法不能用于区分耐药菌株和低耐菌株，因此 抑 菌圈直径19mm 的菌株可能是青霉素耐药或中介甚至是敏感的菌株，对于这些 菌株应该进行肉汤或琼脂稀释试验测定青霉素的 MIC。需要注意的是，苯唑西 林纸片扩散法是用来预测青霉素敏感性的，苯唑西林 MIC本身无价值，因此无 需测定苯唑西林的 MIC。 对于非脑膜炎的菌株，青霉素的 MIC可以预测下列 内酰胺类药物的敏感性： 青霉素 MIC0.06mg/ml(或苯唑西林 抑菌圈直径20mm)提示菌株对氨苄西林(口服或肠外)、氨苄西林-舒巴坦、头 孢克罗、头孢地尼、头孢妥仑、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢唑肟、头孢呋辛、 亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南也敏感；青霉素 MIC2g/ml 提示菌株对阿莫 西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和厄他培南也敏 感。 表 1. 青霉素对肺炎链球菌的敏感性判定折点(g/ml) 必须注意，虽然阿莫西林、氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢 呋辛、厄他培南、亚胺培南和美罗培南可用于治疗肺炎链球菌感染，但对这些 药物尚无可靠的纸片法药敏试验，最好用 MIC法测定其体外抗菌活性。 对于脑脊液中分离出的肺炎链球菌，需尽快用可靠方法检测和报告青霉素和头 孢噻肟(或头孢曲松或美罗培南)的 MIC值。这些菌株也需要用 MIC法或纸片扩 散法报告万古霉素的药敏结果。 表 2. 从脑脊液中分离到的肺炎链球菌需常规报告药物的折点 （2）肺炎链球菌对非 内酰胺类药物的敏感性 CLSI对大环内酯类药物的红霉素、阿奇霉素、克拉霉素和地红霉素给出了纸片 扩散法和 MIC法的折点，并指出红霉素的敏感耐药性可以预测阿奇霉素、克拉 霉素和地红霉素的敏感耐药性。对于尿路分离的菌株，常规不报告大环内酯类 药物的敏感性。 对于临床常用的氟喹诺酮类药物，CLSI 提供了纸片扩散法和 MIC法的折点。并 提示：对左氧氟沙星敏感的肺炎链球菌可预测对吉米沙星和莫西沙星也敏感。 然而，对吉米沙星或莫西沙星敏感的肺炎链球菌不能认为对左氧氟沙星也敏感。 2. 溶血链球菌 CLSI在此部分的描述中， 溶血链球菌包括携带 A群(化脓链球菌)、B 群(无 乳链球菌)、C 群或 G群抗原的大菌落化脓性菌株。而携带 A、C、F 或 G抗原的 小菌落 溶血菌株(咽峡炎链球菌，以前称之为米勒链球菌)则归属于草绿色链 球菌群，药敏折点也应参照草绿色链球菌群。 对于化脓链球菌(A 群)或无乳链球菌(B 群)，青霉素和其他 内酰胺类药物的 25 / 47 药敏试验不需常规进行。这时由于目前还没有耐药菌株的报道。CLSI 表格中所 列出的折点仅是为了药物研发、流行病学以及监测耐药性的目的。任何测定为 非敏感的菌株均需送至参考实验室进行确证。 假如菌株对青霉素敏感，则可以预测对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林克拉 维酸、氨苄西林舒巴坦、头孢克罗、头孢唑啉、头孢地尼、头孢吡肟、头孢 丙烯、头 孢噻肟、头孢布烯(仅对 A群链球菌)、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊 肟、头孢唑肟、头孢拉定、头孢噻吩、头孢匹林、厄他培南、亚胺培南、氯碳 头孢和美罗培南 也敏感，不必再进行这些药物的敏感性试验。对于厄他培南、 美罗培南和达托霉素，CLSI 不推荐使用纸片扩散法实验，也没有提供纸片法的 判定折点。 怀孕期妇女 B群链球菌的预防用药推荐为青霉素或氨苄西林。对于过敏反应低 危的妇女，若对青霉素过敏可改用头孢唑啉；对于过敏反应高危的妇女，若对 青霉素过 敏则改用克林霉素或红霉素。B 群链球菌对氨苄西林、青霉素和头孢 唑啉敏感，但可能对克林霉素和/或红霉素耐药。当对青霉素过敏反应高危的怀 孕期妇女分离出 B 群链球菌时，需对克林霉素和红霉素进行药敏试验并报告。 大环内酯类耐药的 溶血链球菌可以体现出对克林霉素的结构型或诱导型耐药 由 erm基因介导的 23S rRNA甲基化，也称为 MLSB(大环内酯-林可霉素-链阳 霉素 B)耐药，或仅对大环内酯类耐药(由 mef基因介导的外排泵机制)。诱导 型克林霉素耐药 可以用 D试验检测：按照标准的纸片扩散法程序，在 15mg红 霉素纸片周围贴 2mg克林霉素纸片，两纸片的边缘相距 12mm，孵育后，若克林 霉素纸片抑菌圈 靠近红霉素一侧未出现切割现象，则报告菌株对克林霉素敏感。 若克林霉素纸片抑菌圈靠近红霉素一侧出现切割现象(D 形抑菌圈)，则表克林 霉素可被诱导耐药。这样的菌株应报告为“克林霉素耐药”，另外，报告中还 应附上以下内容： “该菌株可诱导出对克林霉素的耐药性。但在某些病人中，使用克林霉素可能 仍然有效。” 3. 草绿色链球菌群 假如菌株对青霉素敏感，则可以预测对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林克拉 维酸、氨苄西林舒巴坦、头孢克 罗、头孢唑啉、头孢地尼、头孢吡肟、头孢丙烯、头孢噻肟、头孢布烯(仅对 A 群链球菌)、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢拉定、头孢噻吩、 头 孢匹林、厄他培南、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南也敏感，不必再进行这 些药物的敏感性试验。对于青霉素、氨苄西林、厄他培南、美罗培南和达托霉 素，CLSI 不推荐使用纸片扩散法实验，也没有提供纸片法折点。 从常规无菌部位(如脑脊液、血液、骨髓)分离出的草绿色链球菌需尽快用 MIC 法检测青霉素的敏感性。对青霉素或氨苄西林中介的菌株需与氨基糖苷类药物 进行联合治疗以达到杀菌效果。 4. CLSI对链球菌属的药敏通用规则： CLSI对链球菌属的药敏有一些通用规则，综述如下： (1) 下列抗菌药物不能常规用于报告脑脊液感染菌株，这些药物治疗脑脊液感 染无效，包括 a. 仅可口服的药物 b. 第一代和第二代头孢菌素(除了静脉用头孢呋辛以外) c. 克林霉素 d. 大环内酯类 e 四环素类 f. 氟喹诺酮类 (2) 若用纸片扩散法进行链球菌的药敏试验，则需测量肉眼判断能完全抑制菌 落生长的抑菌圈直径。抑菌区域以肉眼观察无明显可见的菌落。测量时将平皿 盖子打开，通过反射光从琼脂的上表面测量抑菌圈。忽略抑菌圈边缘的针尖样、 只可通过放大镜观察到的菌落。 (3) 对于一些菌种/抗菌药物组合，发生“非敏感”的几率极低。这些菌种若产 生非敏感的结果，则需再次确认菌株的鉴定和药敏试验。这些菌株需保存并送 至参考实验室确证。 (4) 链球菌的不常见表型： 菌种或菌群 未报道的表型，不常见的表型和/或技术错误导致的结果 在特殊地区不常见 的表型和/或技术 错误导致的结果 氟喹诺酮类耐药 青霉素耐药 利奈唑胺非敏感* 第三代头孢菌素 耐药 肺炎 链球菌 万古霉素非敏感* 氨苄西林或青霉素非敏感* 第三代头孢菌素非敏感* 达托霉素非敏感* 利奈唑胺非敏感* 链球菌， beta 群 万古霉素非敏感* 达托霉素非敏感* 青霉素中介或耐药链球菌，viridans 群 利奈唑胺非敏感 27 / 47 万古霉素非敏感* 笔者注释：CLSI 药敏试验和折点需要不断更新和完善，各位临床微生物室的 同仁们，如果在常规药敏试验中，发现 CLSI指南有任何问题或疑问，请发 Email至 wh_(王辉)，笔者很愿意将这些问题提交至 CLSI年度工作 会议中进行讨论；同时 CLSI 也希望听到中国用户的反馈和意见。 CLSI临床微生物实验室标准解读 CLSI2010更新 CLSI 临床微生物实验室标准解读 第三辑 2010年 CLSI药敏试验的更新 中国医学科学院北京协和医学院 杨启文 王辉 美国临床与实验室标准化研究所(The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)是一个国际性、跨学科、非营利的、致力于发展操作标准的 教育组织。其抗菌药物敏感性试验小组委员会(Subcommittee on Antimicrobial Susceptibility testing)每年组织该领域专家和药厂代表等对 药敏相关文件 M100进行一次修订。目前我国的临床微生物实验室均以 CLSI文 件作为药敏指导文件进行 试验操作和报告，本文将 CLSI M100-S20(2010年)的 主要更新点总结如下： 一、主要格式的更新： 下表显示了一些在 M100-S19(2009年)中位于最后的附录在 M100-S20(2010年) 文件中新的命名、编号和位置。 表 1. M100-S20的格式更新 M100-S19 中的名称 M100-S20 名称/位置 附录 A(ESBLs 的筛选和确证试验) 补充性表格 2A-S1/表 2A 的最后 附录 G(碳氰酶烯酶的筛选和确证试验) 补充性表格 2A-S2/表 2A 的最后 附录 B(金黄色葡萄球菌的筛选试验) 补充性表格 2C-S3/表 2C 的最后 附录 C(凝固酶阴性葡萄球菌的筛选试验) 补充性表格 2C-S4/表 2C 的最后 附录 D(肠球菌的筛选试验) 补充性表格 2D-S5/表 2D 的最后 附录 E(药敏结果的确证建议) 附录 A/ M100-S20 的最后，术语表前 附录 F(药敏试验的质控菌株) 附录 B/ M100-S20 的最后，术语表前 二、表 1和表 2介绍内容中的更新 (1) 修订了“非敏感”的定义：M100-S20 中对“非敏感”的定义是由于耐药菌 株缺失或稀少因而仅确立了敏感性解释标准。当药物对菌株的 MIC高于或抑菌 圈 直径低于此折点时需报告为非敏感。非敏感并不意味着菌株携带某种耐药机 制。有可能 MIC高于敏感折点的菌株缺乏耐药机制并且属于野生菌株，只不过 其出现于 敏感性折点确立后。对于“非敏感”的菌株，菌株鉴定和药敏结果需 被再次确认。 (2) 对“使用头孢噻吩的折点仅用于预测对其他头孢菌素的敏感性”增加注释： 在 M100-S20中，头孢噻吩的折点仅可用于预测菌株对口服药物，包括孢羟氨苄， 头孢泊肟，头孢氨苄和氯碳头孢的敏感性。旧的数据认为头孢噻吩的结果可以 预测某些其他头孢菌素的敏感性可能仍然正确，但目前的数据尚不能支持此论 点。 29 / 47 (3) 在 M100-S20的第 26页增加第 VII部分来描述筛选试验并总结他们的局限 性以及对应的确证试验。该部分总结了 肠杆菌科菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌的 耐药表型初筛试验和对应的确证试 验。 (4) 在表 1和 1A的警告框内，M100-S20 将头霉素类药物加入脑脊液分离菌株 中不能常规报告的抗菌药物列表中。 在 M100-S19中，口服抗菌药物、第一代和第二代头孢菌素(除外静脉用头孢呋 辛)、克林霉素、大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类被列为脑脊液分离菌株 中不能常规报告的抗菌药物，因为这些药物不是脑脊髓感染的选择药物，在 M100-S20中，头霉素类药物(如头孢西丁、头孢美唑和头孢替坦)也被纳入此类 药物。 三、肠杆菌科菌相关的更新 (1) 修订了头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松和氨曲南的 折点，并在折点后增加了对应 的用药方案。 修订折点的原因 在 CLSI文件 M100-S20的第 17页有一个关于折点如何建立的简短注释。本段话 参考的是 CLSI关于折点发展的指南 性文件：M23体外药敏试验标准和质量控制参数的发展。简单地说，修改 折点涉及微生物学、药理学和临床数据的系统性回顾。公认的专家，制药业赞 助商 和监管机构参与这一过程，其中包括 CLSI药敏试验小组委员会每年两次 的在公开会议讨论。若为新的药物建立原始折点，对照的临床试验数据是必需 的。然而在 修改折点时，虽然对照临床试验是可取的，但在处理快速变化的细 菌耐药机制和“老”的药物时这些试验往往并不可行。因此，小组委员会必须 依赖于由发表的文献 资料、专家意见和共识所支持的最佳实践。流行病学、临 床实践以及任何折点修订的监管影响必须予以考虑。 折点需要修订是由于不断变化的耐药机制和细菌菌群分布，不断进步的科学增 进了人们对临床反应药理学因素 的认识以及 “最佳治疗”被临床医生所接受。在临床实践中常规使用的许多药 物折点源于 25年前的临床操作，而这些操作以今天的监管和质量保证标准来看 是不可接受的。不 论在美国和欧洲，不断评估和更新折点已得到了微生物学家、 临床医生和监管机构的普遍认同。例如，2007 年通过的美国食品和药物管理法 修正案 (FDAAA)规定 FDA更新折点，并且美国 FDA已经在 2009年作出回应，为 行业印发指导文件，以在系统性抗菌药物产品和药敏试验设备中更新药敏试验 信息标记。M100-S20 修订后的折点能更好地反映抗菌药物在以目前推荐方案治 疗由菌株引起的感染时的真实疗效。对产 ESBL菌株的研究结果发挥了重大 作 用。最初 CLSI推荐进行 ESBLs筛选及确证测试，并规定对于产 ESBL的菌株， 将青霉素，头孢菌素和氨曲南的药敏结果由敏感改为耐药，这条规定基于 以下 几点：1) 研究观察到某些产 ESBL菌株，以上药物的 MIC有升高但仍然在敏感 区间(使用旧的折点)；2) 有限的临床观察发现，对于产 ESBL菌株引起的感染， 病人预后较差。ESBL 试验建议是处理一个新型耐药机制的短期解决方案。随后， 更多的耐药机制被发现 (例如，新型的 ESBLs和 AmpC酶)，并且越来越多的菌 株被发现产多种酶导致 ESBL的检测更加复杂。以上事实以及人们对头孢菌素类 和单环 内酰胺类 的 PK-PD因素对治疗效果决定作用的认识导致折点的变更。 折点修订后，ESBLs 筛选和确证试验将不再是决定治疗策略所必需。当菌株产 多种酶时(如当菌 株同时产 ESBLs和 AmpC酶时将导致假阴性的结果)ESBL 表型 检测和确证试验的准确性将降低，而在当前，产多种酶的菌株已非常普遍。菌 株的 MIC与 临床预后的相关性强于菌株携带的耐药机制。CLSI 认为，新的折 点将为病人治疗提供更合理的信息并降低临床实验室工作的不确定度和工作量。 新折点与旧折点的比较 对于肠杆菌科菌，头孢菌素和氨曲南的折点修订如下(作为比较，也列出旧的折 点)： 表 2. M100-S20 MIC折点更新 (g/ml): 旧 (M100-S19) 新 (M100-S20) 抗菌药物 敏感 中介 耐药 敏感 中介 耐药 头孢唑啉 8 16 32 1 2 4 头孢噻肟 8 16-32 64 1 2 4 头孢唑肟 8 16-32 64 1 2 4 头孢曲松 8 16-32 64 1 2 4 头孢他啶 8 16 32 4 8 16 氨曲南 8 16 32 4 8 16 表 3. M100-S20纸片扩散法折点更新(mm): 旧 (M100-S19) 新 (M100-S20) 抗菌药物 敏感 中介 耐药 敏感 中介 耐药 头孢唑啉 18 15-17 14 NA NA NA 头孢噻肟 23 15-22 14 16 23-25 22 头孢唑肟 20 15-19 14 25 22-24 21 头孢曲松 21 14-20 13 23 20-22 19 头孢他啶 18 15-17 14 21 18-20 17 氨曲南 22 16-21 15 21 18-20 17 NA=未确定 与头孢唑啉修订后 MIC折点相关的抑菌圈直径折点尚未确立。初步的研究并没 有确立明确的抑菌圈直径折点， 31 / 47 并且头孢唑啉的纸片扩散法试验可能需要使用一种改变含药剂量的新型纸片。 另外，以下药物对肠杆菌科菌的折点也被重新评估但没有被修改(这些药物的纸 片扩散法折点也没有被修改)： 表 4. M100-S20 MIC折点(g/ml) 旧 (M100-S19) 新 (M100-S20)抗菌药物 敏感 中介 耐药 敏感 中介 耐药 头孢呋辛(肠外) 8 16 32 8 16 32 头孢吡肟 8 16 32 8 16 32 头孢替坦 16 32 64 16 32 64 头孢西丁 8 16 32 8 16 32 头孢西丁折点不修改是因为当前数据支持现有的折点。 PK-PD 评估表明，推 荐的药物剂量在目标范围内。头 孢替坦的折点未改变是因为没有足够的数据支持。头霉素类不被 ESBLs水解并 且头霉素的敏感结果不会由于 ESBLs的确证试验阳性而改为耐药。 头孢吡肟折点没有修改是基于临床试验数据和 PK - PD评估。临床试验证实了 对于产 ESBL但头孢吡肟敏感(MIC 8g/ml)的菌株感染的病人，头孢吡肟是有疗效的。PK- PD 评价结果表明，头 孢吡肟日剂量超过 3克(即每 8小时 1克或每 12小时 2克)可以使头孢吡肟的药 物浓度达到评估折点时所使用的目的暴露标准。 数据回顾显示，没有必要修订现行的头孢呋辛(注射)折点，但需注意现行折点 只适用于每 8小时 1.5克或更高的给药剂量。 对于一般不在美国使用或销售的头孢菌素，如头孢孟多，头孢尼西，头孢哌酮 和拉氧头孢，其折点没有重新评 估。因此，当测试这些药物对大肠杆菌、克雷伯菌属和奇异变形杆菌的抗菌活 性时，需要进行 ESBLs筛选和确证试验。对于 ESBL确证试验阳性的菌株，这些 药物的敏感结果均需报告为耐药。 注射用头孢噻吩不再在美国使用。由于与肠杆菌科相关，口服头孢噻吩主要用 于尿路感染的治疗。头孢噻吩的 敏感性结果可代表其他几种 FDA批准用于治疗尿路感染的口服药物的活性，包 括头孢羟氨苄，头孢泊肟，头孢氨苄和氯碳头孢。故 M100-S20将头孢噻吩由检 测/报告 A组转至 U组。 使用新折点的报告原则： 当使用经修订的折点则没有必要进行 ESBL初筛和确证试验来报告结果以指导病 人治疗。决定是否为感染控制或 流行病学目的进行 ESBLs确证试验应与传染病医生，药剂师以及感染控制委员 会的医务人员进行讨论决定。新的折点应与各单位的实验室报告相关人员共同 讨 论。传染病医生，药剂师和其他了解抗菌药物治疗的医务人员应教导其他医 生关于折点修订的情况以及如何用新折点指导药物使用。重要的是，那些使用 药敏结果指 导治疗决策的 医生须知道，新的折点适用于美国 FDA批准的给药方案(如 M100-S20表 2A所列) 。这些反映了来自制药公司处方信息或产品标签的成人标准治疗剂量。 各医疗 机构的药物剂量和药物调整政策需重新评估以保证与 CLSI推荐折点相一致，因 为临床医生不太可能要求实验室的常规报告上注明给药方案。 修订后折点与 ESBL的关系 不是所有的产 ESBLs菌株使用新修订的折点均检测为耐药。修订后的头孢菌素 和氨曲南折点都关注于 MIC和药 代动力学而不是耐药机制。正如前所示，某些 ESBL水解某些头孢菌素的能力强 于其他药物，从而导致某些药物(如头孢噻肟)对产酶菌株的 MIC明显高于其他 药物(如头孢他啶)。另外，不同菌株的产酶量是有差异的，因此当产酶量多时 MIC会升高。 当使用经修订的折点则没有必要进行 ESBL初筛和确证试验来报告结果以指导病 人治疗。某种耐药机制可以导 致不同强度的耐药性，如 ESBL对头孢菌素和氨曲南。这些差异可以导致不同的 MIC。例如，一些产 ESBL菌株用修订后折点对头孢他啶敏感但对头孢曲松耐 药。 同样，另一个产 ESBLs菌株可能对头孢曲松敏感而对头孢他啶耐药。目前建议， 这些头孢菌素的敏感结果在报告时不改为耐药，因为研究表明，MIC 是产