伊天磊+开题报告

本 科 生 毕 业 设 计（论 文） 开题报告 题目：市售活性乳酸菌产品中实际活菌数检测 姓 名： 伊天磊 学 号： 201004050129 指导教师： 王联结 班 级： 食品质量与安全 101 班 所在院系： 生命科学与工程学院 本科生毕业设计（论文）开题报告考核 一、导师对开题报告的评语： 指导教师 200 年 月 日 二、开题报告答辩评语及成绩: 成绩 市售活性乳酸菌产品中实际活菌数属检测 一、选题的目的和意义： 随着人们生活水平的提高及自我保健意识的增强，乳制品日益受到广大消 费者的喜爱。酸奶中含有大量的活性乳酸菌。乳酸菌可定居在人体的鼻黏膜或 消化道等处，所产生的代谢产物能降低肠道内的 pH 值，抑制肠道中腐败菌生长， 减弱腐败菌在肠道的产毒作用，从而维持体内微环境，尤其是肠道内正常的微 生态平衡。用于普通酸奶的乳酸菌菌种主要是嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌； 益生菌酸奶的乳酸菌菌种有嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳 杆菌等。乳酸菌活菌体需达到一定数量才有可能到达并定植在人体肠道内， 抑制有害菌的增殖和活动，维持肠道的微生态平衡，增进人体的健康。对这类 产品质量检测时进行活菌计数，即用乳酸菌数量来评价活性乳酸菌制品的质量 显得尤为重要。 我国现在执行的标准中，对乳酸菌数在保质期内的要求过低，造成市场上 大量低品质产品的出现，而乳酸菌既然作为活性乳酸菌饮料中的一个组成，在 保质期内应保持一定数量级，才能起到活菌应有的作用。低标准会使乳酸菌饮 料生产企业的准入门槛降低，这就会使大量的短期投机企业涌入该行业，从而 导致恶性的价格战。而这种价格上的低层次竞争又会使酸菌生产企业的质量和 服务明显下降，最后影响到消费者对市场的信心。这正是乳酸菌市场的最大隐 忧。专家认为，在乳酸菌行业蓄势待发的关键时期，科学地制订与国际标准相 接轨的国标是规范市场、形成中国乳酸菌行业持久竞争力的关键。 掌握乳酸菌饮料中活菌的检测方法：要了解饮料中可能存在活菌的特性,并 进行分析、掌握样品稀释处理的方法、掌握培养基的制备、并选择合适的培养 基,掌握菌落的培养方法、掌握活菌的理化检测方法。 二、国内外目前主流检测方法 1.血球计数板（改良牛鲍计数板） 用优质厚玻璃制成。每块计数板由 H 形凹槽分为 2 个同样的计数池。计 数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高 0.10mm 的计数 池。计数池画有长、宽各 3.0mm 的方格，分为 9 个大方格，每个大格面积为 1.0 毫米 X1.0 毫米=1.0 平方毫米;容积为 1.0 平方毫米 X0.1 毫米=0.1 立方毫米。其 中，中央大方格用双线分成 25 个中方格，位于正中及四角 5 个中方格是红细胞 计数区域（图中浅红色区域），每个中方格用单线划分为 16 个小方格。四角的 4 个大方格是白细胞计数区域（图中浅蓝色区域），每个大方格用单线划分为 16 个中方格。根椐国际标准局（NBS）规定，大方格每边长度允许误差为1%。 2.比浊计数 当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降 低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光 密度或透光度可以由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定 光密度，作出光密度 菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准 曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数， 平板菌落计数或细胞干重测定等方法。 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在 一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液， 用光密度( OD 值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜 色太深的样品，不能用此法测定。 光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但 是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养 液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行 光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在 400700nm 之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定 性试验来确定。 3.稀释平板计数法 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单 个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖 而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落 数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测 样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中 的 23 或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平 板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表 示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定 结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的 信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水包 括水源水等的含菌指数或污染程度的检测。 3、选题的依据 1.选题目的 发酵乳必须含有大量活的乳酸菌(杀菌型除外)。 日本厚生省规定的发酵乳 制品标准中，含非脂乳固体 8以上的产品中活菌数应在每毫升 1000 万个以上， 含非脂乳 固体 8以下的产品中活菌数应在每毫升 100 万个以上。GBl1673- 89 国标出台乳饮料标准规定含乳 30以上的产品中，蛋白质1乳酸菌活菌 数 100 万个鹰升。出台以上规定是必要的，目前市场上一些称为活性乳酸菌饮 料的产品，含乳酸菌活菌数与标准相差甚远，有的甚至根本不含活的乳酸菌。 市售的活性乳酸菌产品主要以乳酸菌饮料为主。由于东方人种普遍存在乳 糖不耐症的因素，和人们追求健康美味的乳品饮料环境的驱使下，乳酸饮料越来 越被人们所接受，并在饮料市场上占有很大的比重。但是，随着市场的飞速发展， 导致市面上乳酸饮料的品质也参差不齐，所以本课题就以活性乳酸菌产品的重要 指标活菌数量展开研究和讨论。 当人们饮用了乳酸饮料后，乳酸菌便沿着消化道到大肠。由于它具有活性， 乳酸菌在人体的大肠内迅速繁殖，所产生的代谢产物能降低肠道内的 pH 值，抑 制肠道中腐败菌生长，减弱腐败菌在肠道的产毒作用，从而维持体内微环境，尤 其是肠道内正常的微生态平衡。可见乳酸活菌的数量决定了饮料的品质和功效。 但就目前市场上的乳酸菌饮料而言，其活菌含量非但极少，甚至无法达到国家标 准。所以探究一个快速准确的活菌数测定指标是检验品质所必须的。通过自己的 实验和分析进一步探究出简洁的适合目前中国市场乳酸饮料活菌数量的检测方法。 目前测定乳酸菌活菌数多用平板法。由于用常规 的培养基乳酸菌生长较慢， 出现可计数的菌落要 2 3d 甚至更久 对工厂来说很不方便。所以要对培养 基及测定方法作些改进，使菌落显著形成的时间缩短到 16-20h(甚至 12h)可较 方便地使用。 3.2研究依据 根据陕西科技大学食品 2013 年毕业设计任务书的要求，在老师的指导帮助 下，参考大量文献资料，进行设计。 4、 研究内容： 1.问题与方法 在论文中，主要对现有市场上出售的乳酸饮料进行抽样检验，借助现有的 检测技术对样品进行活菌数量和活菌品种进行测定，通过实验得出不同品牌产品 的活菌数量，和其含有的活菌种类。最后总结出合理科学的完整检测方案，同时 总结出方案中的问题和不足。 实验待解决和讨论的问题： 1、市售活性乳酸菌产品的选择是否有代表性，和多种样品之间的变量差 异都有哪些？ 2、在样品活菌培养时，如何能够即准确并且较为简化的培养出菌落用于 技术和测定？ 3、在菌数的计量中，如何尽可能的缩小误差并准确的得到数据？ 4、在对菌落进行生化实验时，通过怎么样的方法可以明显的鉴别出不同 的活性菌？ 本课题采用文献研究法和实验分析方法进行研究。即首先参考相关文献 了解国际上热门的检测方法，再通过实际的采样，处理样品，制备培养基，菌落 培养，菌落计数来得知活菌的数量。再通过生化实验对照常见细菌系统鉴定手 册来研究不同产品是否中嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆 菌等菌类的存在。最后根据产品菌类存在情况，结合菌类特性选择最适合的培养 基、培养方法以及检测方法，总结出最有效可行的活菌数量检测方案。 全过程可总结为：先通过文献研究法全面正确的掌握国内外就活菌数检测 的方法，再通过具体抽样实验分析，完全掌握活菌数量的测定方法并进一步优化 或改良已知方法。 2 .操作内容 1样品稀释无菌操作。用灭菌金属勺搅拌样品后，以无菌吸管吸取 05ml 样品加入到盛有 45 ml 无菌生理盐水的试管中，然后另换一支吸管插入 101 试 管中反复吹吸 10 余次，根据需要，将样品按上述操作以 10 倍梯度稀释至 10-7。 2倾注法接种平板选择 10-6、10 -7两个稀释度，分别吸取不同稀释度的稀 释液 1 ml 置于编好号的无菌平皿内。每个稀释度做 2 个重复，然后倒入融化后 并冷却至 46-50的 MRS 固体培养基 12-15ml，置水平位置迅速轻轻转动平板， 使稀释液与培养基混合均匀，冷凝成平板。 3.厌氧培养用焦性没食子酸法进行厌氧培养。置予温箱中 37培养 60h。 4茵落计数方法选择菌落数在 30-300 之间的平板作为菌落总数测定的标准， 且 1 个稀释度使用 2 个平板的平均菌落数。 5.分离培养从上述 7 种品牌酸奶乳酸菌培养物中分别挑取革兰氏染色阳性、 过氧化氢酶试验阴性的单个菌落在 MRS 平板上反复划线分离以获得纯菌株，将划 线平板厌氧条件下 37培养 48-72 h。革兰氏染色镜检。 6.生化试验 6.1 触酶试验用接种环分别从 7 个品牌酸奶的纯培养物中挑取菌落放于载玻 片的中央，加一滴 3H 202(现用现配)于菌落上，立即观察有无气泡出现。 6.2 糖发酵试验(微量发酵管法) 取乳酸菌的纯培养物分别接种到葡萄糖、 乳糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇培养基中开口朝下，37培养 24h，观察 结果并作记录。 63 甲基红试验(MR 试验) 取 7 个品牌酸奶乳酸菌的纯培养物接种到葡萄糖 蛋白胨水培养基中，37培养 4h，取出后加入甲基红试剂 35 滴，出现红色者 为阳性，黄色者为阴性。 64 吲哚试验以接种环勾取乳酸菌单个菌落接种于蛋白胨水中，37培养 24 h。取出后加入吲哚试剂，出现玫瑰环的为阳性，不变色者为阴性。 65 硫化氢试验分别用接种针蘸取 7 个品牌酸奶乳酸菌的纯培养物，沿试 管壁作穿刺三糖铁培养基，37“C 培养 24h，培养基变黑者为阳性。 66 枸橼酸盐利用试验用接种针挑取菌落在枸橼酸琼脂斜面划线并穿刺， 37培养 24 h，培养基由草绿色变为深蓝色为阳性。不变色者为阴性。 5计划安排 1、选题：2013 年 12 月。 2、开题：2014 年 1 月 15 日 2 月 15 日，拟定论文写作提纲即开题报告。 2、第一稿：2014 年 4 月 1 日2014 月 4 月 15 日，撰写论文初稿。 4、第二稿：2014 年 4 月 16 日5 月 15 日，查阅资料，撰写论文第二稿 5、第三稿：2014 年 5 月 16 日5 月 30 日，再次修改论文，完成第三稿 6、定稿：2014 年 6 月 1 日6 月 15 日，完成论文定稿，并申请论文答辩 7、答辩：按学院统一安排，撰写论文答辩提纲，准备答辩。 6参考文献 1东秀珠。蔡妙英等常见细菌系统鉴定手册 IM北京：科学出版社。 2遇婷，张瑞华。吴泓等乳酸菌计数有关问题的探讨J实用预防医学. 3刘文华，任慧英，邹玲等，活性乳酸菌饮品的质量检查 J1检测与分析， 2008. 4遇婷，张瑞华。吴泓等乳酸菌计数有关问题的探讨J实用预防医学， 2002,9 (5) 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Journal of the A