实验设计在adc药物处方筛选中的应用

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 实验设计在 ADC 药物处方筛选中的 应用 摘 要 目的：运用实验设计 （DOE ）方法优化抗体偶联药物 （ADC）处方筛选，以得到适用于该 ADC 药物的较优处方。方法：利用 JMP 10 软件进行 DOE，考察蛋白浓度、 pH、蔗糖和吐温 20 浓度等因素对 ADC 药物稳定性的影响。结果：经过 DOE 方法的优化，得到了蛋白浓度（10 mg/ml） 、pH （5.0） 、蔗糖浓度 6%（w/v）和吐温 20 浓度 0.02%（w/v ）的优选组合。结论： DOE 方法能优化处方，提高 ADC 药物 的稳定性，为其他 ADC 药物的处方筛 选提供了借鉴。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 中国论文网 /6/view-12995511.htm 关键词 实验设计 ADC 药物 处 方筛选 中图分类号：R927.11； R979.19 文献标识码：A 文章编号： 1006-1533（2018）01-0071-05 Application of design of experiment in the formulation screening of antibody drug conjugate DU Yi， ZHANG Yanzhen， TAN Xiaoding* （Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 200237， China） ABSTRACT Objective： To optimize the formulation screening of antibody drug conjugate （ADC） by a method of design of experiment （DOE ） so as to obtain a superior formulation for the ADC drug. Methods： DOE was performed by a software JMP 10 to investigate the effects of the -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 concentrations of protein， sucrose and polysorbate 20 and pH value on the stability of ADC drug. Results： A preferred combination including 10 mg/ml protein， 6% （w/v） sucrose and 0.02% （w/v） polysorbate 20 and pH 5.0 was obtained by optimization of DOE method. Conclusion： DOE can optimize the formulation and improve the stability of ADC drug. 选择性较强，不良反应较轻， 但是由于单克隆抗体靶向治疗的有效率 并不高，且存在耐药与疗效问题，因此， 抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）作为一种新型药物结 合了抗体的靶向性和小分子药物的细胞 毒作用1-2 。 ADC 药物进入体内后， 通过单抗的导向作用与靶细胞表面的抗 原结合，进入靶细胞内，然后通过化学 或酶促作用释放小分子药物而杀灭靶细 胞3。 ADC 药物制剂处方开发的目标 是确保为患者提供质量稳定可靠的产品。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 与传统单抗药物相比，在安全、质量和 疗效等方面，ADC 药物具有其独特的 物理化学性质。其质量属性通常可以分 为三类：与抗体本身相关、与小分子药 物相关及与抗体-小分子偶联形式相关。 如抗体本身相关的聚体，可影响药物的 免疫原性4及药代动力学特性；游离小 分子会影响药物的安全性；抗体药物偶 联比可影响药物安全性和药代动力学特 性5。这些关键属性都可能因处方的不 同而改变，因此，筛选出好的处方对于 ADC 药物保持良好的稳定性和安全性 具有重要意义。 实验设计（DOE）是以数理统计 和概率论为基础、合理安排实验的方法 论，研究如何制定实验方案，以提高效 率，缩小误差，高效且经济地获取数据， 并进行分析处理，最后得出正确的结论。 传统的多数设计是先追求目标值，通过 筛选不同因素来减少波动，结果只能得 到单因素的最优化，但是由于参数搭配 不佳而整体性能不稳定。田口方法则是 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 先追求产品的稳定性，通过分析质量特 性与不同元素之间的非线性关系（交互 作用） ，找出稳定性的最佳水平组合6-7。 随着 DOE 的广泛使用，越来越多的 DOE 软件得到开发和应用，如 SPSS、Minitab、JMP 等。其中，JMP 是赛仕软件公司（Statistical Analysis System）推出的一种交互式可视化统计 分析软件，其实验设计内容丰富，实验 设置灵活，分析功能强大，可大大提高 实验效率8-10。因此，本研究应用 JMP 10.0 软件进行田口实验设计，对得 到的数据进行分析，预测实验结果并找 出最佳参数。 1 材料与方法 1.1 ADC 药物 本研究中的 ADC 药物为注射用 重组抗 HER2 人源化单克隆抗体-MCC- DM1 偶联剂，是一种由氨基酸序列和 曲妥珠单抗（赫赛汀，herceptin）相同 的抗体与细胞毒类药物美登素衍生物 （DM1）通过不可裂解的硫醚连接桥偶 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 联而成的制剂，连接分子（linker）为 SMCC。由上海医药集团股份有限公司 中央研究院生物药物室制备。 1.2 主要仪器和试剂 BSA822 电子天平（赛多利斯公 司） ；Akta avant 蛋白纯化系统（ GE） ； 1260 高效液相色谱仪（安捷伦公司） ； SpectraMax M5 多功能酶标仪及 SoftMax 分析软件（美国 Molecular Devices） ；PA 800 plus 毛细管电泳仪 （贝克曼公司） ；紫外分光光度计 （Thermo Fisher Scientific） 。琥珀酸、 吐温 20（J. T. Baker） ；蔗糖、氢氧化钠 （湖南尔康制药股份有限公司） ；超纯 水（自制） 。 1.3 处方 DOE 设计 根据单因素实验结果选取蛋白浓 度、pH、蔗糖浓度及吐温 20 浓度用于 DOE 试验。利用 JMP 10.0 进行 DOE 设 计，其中蛋白浓度选取 3 水平、pH 为 2 水平、蔗糖浓度为 3 水平、吐温 20 浓 度为 3 水平，共设计 18 个试验组（表 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 1） 。 1.4 缓冲液置换及稳定性考察 称取适量的蔗糖、琥珀酸和吐温 20 溶解于超纯水中，用 3 mol/L 氢氧化 钠调节溶液 pH，配制成表 1 中的不同 蔗糖浓度、不同 pH 和不同吐温 20 浓度 的处方缓冲溶液。 使用 Akta avant 蛋白纯化系统连 接分子筛将适量的 ADC 药物样品置换 至上述配制好的处方溶液中。置换好后 的溶液无菌过滤并分装至 6 ml 的灭菌 西林瓶中，压塞， 加铝塑盖，在 25 条件下进行 加速稳定性实验，考察时间为 3 个月。 2 质量指标 方法均为企业自行开发并验证。 2.1 尺寸排阻色谱法（SEC）纯 度分析 色谱柱：TSKgel G3000SWXL（7.8 mm300 mm，5 mm） ； 流动相：（20 mmol/L 磷酸二氢钾+0.25 mol/L 氯化钾，pH=6.950.05）-异丙醇 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 =8515；流速：0.5 ml/min；上样量： 100 mg；柱温：室温；样品池温度：8 ；检测波长：280 nm。用 Agilent 1260 高效液相分析系y 对实验结果进 行数据处理，用面积归一化法计算纯度。 2.2 CE-SDS 纯度分析 将样品用纯水稀释至 5.0 mg/ml，将 20 ml 样品、75 ml SDS-MW 样品缓冲液、2 ml 内标和 5 ml 0.25 mol/L 碘乙酰胺（非还原 CE-SDS）混 匀后，65 孵育 4 min，冷却至室温， 取 100 ml，采用 Beckman PA800 plus 毛 细管电泳系统上样分析， 于 15 kV 分 离，毛细管温度及样品传送带温度均为 20 ，检测波长为 220 nm。 2.3 游离小分子分析 色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB-C18（ 4.6 mm100 mm，3.5 mm） ； 流动相：0.02% TFA 水溶液（流动相 A） ，0.02% TFA 乙腈溶液（流动相 B） ； -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 流速：1.0 ml/min；上样量： 20 ml；柱 温：30 ；检测波长：252 nm。用 Agilent 1260 高效液相分析系统对实验 结果进行数据处理，用面积归一化法计 算游离小分子的量。 2.4 体外生物学活性分析 0.25% Trypsin-EDTA 消化 BT- 474 细胞，用 DMEM/ F12 完全培养基 将细胞重悬，调整活细胞密度至 1.5105 cells/ml，100 ml/孔加入 96 孔 板，37 ，5% CO2 恒温培养箱中培养 24 h。用 DMEM/F12 完全培养基将抗 体稀释至 5 mg/ml，再用稀释液 2 倍系 列稀释（共 9 个梯度） ，50 l/孔加入 96 孔细胞培养板，以 DMEM/F12 完全培 养基作为阴性对照，以参比品作为阳性 对照。37 ，5% CO2 恒温培养箱中培 养 5 d，加入 CCK-8 染色液，每孔 25 ml。5% CO2、37 恒温培养箱培养 46 h。以 450 nm 读取酶标仪上吸光度 值。结果计算：利用 SoftMax 软件分析 数据，以抗体浓度对数为横坐标，对应 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 吸光度值为纵坐标，选用四参数方程回 归模型，拟合抗体剂量效应曲线。按下 式计算生物学活性： 3 结果 3.1 处方筛选 SEC、CE-SDS、游 离小分子及体外生物学活性结果 本研究中采用 SEC 聚体、CE- SDS 小分子片段、游离小分子含量及体 外生物学活性进行后续的分析，结果如 图 1 所示。 25 加速条件放置下，SEC 聚 体、CE-SDS 小分子片段和游离小分子 3 个月与 0 个月的差值越小表示处方前 后变化越小，越稳定。图 1 初步显示： 可以看出高浓度蛋白的处方 SEC 聚体 变化明显高于低浓度蛋白的处方。低、 中浓度蛋白组的体外生物学活性整体高 于高浓度蛋白组。 3.2 处方 DOE 数据分析 选择 SEC 聚体、CE-SDS 小分子 片段、游离小分子 25 加速 3 个月与 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 0 个月时的变化值和 3 个月时各处方的 体外生物学活性为响应值，应用 JMP 10.0 软件对田口正交表 L18（2133） 中的处方进行预测刻画，刻画结果如图 2 所示，各处方的刻画意愿如表 2 所示。 图 2 显示 pH 较低时，处方的意 愿增高；蛋白浓度 10 mg/ml 和 20 mg/ml 对于整体意愿的影响比 30 mg/ml 小；10 mg/ml 时的最佳处方意愿值 0.76，20 mg/ml 时的最佳处方意愿值为 0.71，30 mg/ml 时最佳处方意愿值仅 0.51。因此为了保证 ADC 药物的稳定， 处方蛋白浓度应该低于 30 mg/ml。表 2 显示处方 B 和处方 H 的意愿值分别为 0.76 和 0.71，二者的意愿值相差不大， 为了后续工艺的可行性及临床使用的方 便性和安全性，最终选择蛋白浓度为 20 mg/ml，即最后选择的 ADC 药物的较 优处方为处方 H，即 pH 5.0、蛋白浓度 20 mg/ml、蔗糖含量 6%（w/v）及吐温 20 含量 0.02%（w/v） ，并对该处方的一 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 批成品进行长期稳定性考察。 3.3 长期稳定性考察结果 对上述处方下的一批成品进行长 期稳定性考察。长期稳定性试验温度定 为 28 ，考察 12 个月。分别在试验 期第 0、3、6、9、12 个月末取样分析 SEC 纯度、游离小分子药物、DAR 和 生物活性等相关指标，结果如图 3 所示。 图 3 表明成品在 28 条件下 放置 12 个月期间，SEC 纯度、CE-SDS 纯度、生物学活性、游离小分子和 DAR 均无明显变化。说明在优化处方 （处方 H）下，样品在 28 条件放 置 12 个月后质量稳定性良好。 4 讨论 本研究通过对蛋白浓度、pH、蔗 糖浓度和吐温 20 浓度的优化，筛选出 优化处方 H，即 20 mg/ml ADC 药物、 6%（w/v ）蔗糖、0.02% （w/v）吐温 20 和 pH 5.0。在该处方下，样品在 25加 速 3 个月后，聚