散结通络方对缺血性肾病晚期大鼠mmp―2、timp―2表达的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 散结通络方对缺血性肾病晚期大鼠 MMP2 、TIMP2 表达的影响 摘要 目的 探散结通络方对 缺血性肾病晚期大鼠肾组织基质金属蛋 白酶 2（MMP-2 ） 、基质金属蛋白酶组 织抑制因子 2（TIMP-2）表达的影响。 方法 将 SD 雄性大鼠按随机数字表法分 为假手术组、模型组（均给予生理盐水 3 mL/d） 、药物组散结通络方 10.85 g/（kg d），采用单侧肾动脉不全结 扎术建立模型。于实验第 28 天检测大 鼠 24 h 尿蛋白定量及血肌酐。处死大鼠， 取肾组织做光镜检查，观察各组大鼠肾 脏形态学改变；免疫组化法检测肾组织 MMP-2、TIMP-2 表达。 结果 光镜下 模型组和药物组大鼠的肾小球及肾小管 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 间质均有损伤。与假手术组比较，模型 组和药物组肾小球硬化指数评分及肾小 管间质损伤评分均明显升高（P 中国论 文网 /6/view-12954883.htm 关键词 散结通络方；缺血性肾 病；基质金属蛋白酶 2；基质金属蛋白 酶组织抑制因子 2；大鼠 中图分类号 R692 文献标识码 A 文章编号 1673-7210（2017） 10（b）-0024-04 Effects of Sanjie Tongluo Decoction on the expression of matrix metalloproteinase 2， tissue inhibitor of metalloproteinase 2 in rats with ischemic nephropathy of advanced stage WANG Rui1 CHEN Guimei1 LI Wei1 LIU Lanying1 LI Jiaoyan1 LI Genmao2 GE Dongyu2 WANG Yaoxian3 1.Department of Nephrology， the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2.Basic Research -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 Center， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 3.Department of Nephrology， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China Abstract Objective To investigate the effects of Sanjie Tongluo Decoction on the expression of matrix metalloproteinase 2 （MMP-2） ， tssue inhibitor of metalloproteinase-2 （TIMP-2） of nephridial tissue in rats with ischemic nephropathy of advanced stage. Methods Male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group （both groups were given normal saline 3 mL/d） ， drug group Sanjie Tongluo Decoction 10.85 g/（kg d） by random number table method. The unilateral renal artery insufficiency ligation was used to establish animal model. In the 28th day of experiment， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 the levels of 24 hours urinary protein and creatinine of rats were detected. The rats were put to death and nephridial tissue was collected to take light microscope examination， the changes of renal morphology in all groups were observed. Immunohistochemistry was used to detect the expression of MMP-2 and TIMP-2 of nephridial tissue. Results Under the light microscope， the glomerulus and tubulointerstitium in the model group and drug group had damage. Compared with sham operation group， the scores of glomerulosclerotic index and tubulointerstitial lesion in the model group and drug group were all increased （P 0.01） ， which of drug group were lower than those of model group （P 0.01）. Compared with model group， the expression of MMP-2 in drug group was increased （P 0.01） ， 24 hours urinary protein， creatinine and the expression of -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 TIMP-2 were decreased （P 0.01） ， which of both groups were higher than those of sham operation group （P 0.01）. Conclusion Sanjie Tongluo Decoction can prevent the lesions of ischemic nephropathy of advanced stage by up-regulating the expression of MMP2 and down-regulating the expression of TIMP-2. Key words Sanjie Tongluo Decoction； Ischemic nephropathy； Matrix metalloproteinase 2； Tissue inhibitor of metalloproteinase 2； Rats 缺血性肾病是指肾动脉狭窄或阻 塞，超过管腔 60%，造成肾脏血流动力 学改变，肾脏严重缺血而导致慢性肾脏 病1。本课题组在临床应用散结通络方 治疗缺血性肾病晚期患者有显效的基础 上2，通过对缺血性肾病晚期大鼠肾组 织病理变化及应用免疫组化法测定基质 金属蛋白酶 2（MMP-2 ） 、基质金属蛋 白酶组织抑制因子 2（TIMP-2）在肾组 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 织中表达的变化，探讨散结通络方干预 缺血性肾病的作用机制。 1 材料与方法 1.1 动物 SPF 级雄性 SD 大鼠 30 只， 23 月龄，体重 190220 g，北京维通 利华实验动物有限公司提供，合格证号： SCXK（京） 2012-0001。经北京中医药 大学伦理委员会批准。饲养于北京中医 药大学实验动物房，每笼 10 只，温度 （232），湿度（555）%，12 h 光 暗循环，自由饮水，普食。 1.2 主要试剂 MMP2 抗体（BA0569） 、TIMP2 抗体（BA0576） （武汉博士德生物工程 有限公司） ；血肌酐测试盒（D130916） （南京建成生物工程有限公司） ；尿微 量白蛋白检测试剂盒（Axis-Shield PoC AS） 。 1.3 药物 散结通络方（北京康仁堂药业有 限公司配方颗粒剂） ，具体组成如下： -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 生黄芪 10 g、当归 10 g、党参 10 g、熟 大黄 5 g、川芎 10 g、地龙 10 g、海藻 10 g、牡蛎 30 g、莪术 10 g、夏枯草 30 g。 1.4 方法 1.4.1 分组 将 36 只雄性 SD 大鼠 按照随机数字表法分为假手术组（12 只） 、模型组（12 只） 、药物组（12 只） 。 1.4.2 建模 大鼠适应性生长 1 周 后，禁食不禁水 12 h， 10%水合氯醛 （0.4 mL/kg）腹腔麻醉后剪开腹腔，药 物组和模型组剥离出左侧肾动脉，将 0.25 mm40 mm 的针灸针与肾动脉长轴 平行放置，用 1 号手术缝合线将肾动脉 和针灸针扎在一起，抽出针灸针，关闭 腹腔（动脉结扎为同一人操作） 。假手 术组只打开腹腔后缝合。术后次日自由 进食水。药物组 2 只死于麻醉意外，模 型组 2 只建模次日死亡，假手g 组无 死亡，为数据一致，假手术组随机取 10 只大鼠。 据缺血性肾病文献3制订造模成 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 功的标准，具体如下：实验动物伤口 愈合。体重下降，饮食运动量减少， 体毛无华。尿蛋白及血肌酐升高。 手术侧肾脏体积缩小。镜检：肾小管损 伤为主，肾小管结构明显破坏，小管上 皮细胞脱落、凋亡及坏死变性，小管萎 缩，肾间质炎症细胞弥漫性浸润，肾小 球系膜细胞增生，皮髓质胶原纤维广泛 沉积，肾间质纤维化伴肾小球硬化。 1.4.3 给药方法 各组大鼠均从术 后次日开始灌胃。药物组：散结通络方 10.85 g/（kg d） （人临床用量的 7 倍） ， 每日 1 次；模型组和假手术组：生理盐 水 3 mL，每日 1 次。连续用药 28 d。 1.5 观察指标及检测方法 1.5.1 生化指标 大鼠于代谢笼中， 禁食不禁水，收集 24 h 尿液，测定 24 h 尿蛋白定量。于 10%水合氯醛溶液腹 腔麻醉，腹主动脉取血 35 mL，3000 r/min 离心 5 min，血清保存于 -20冰 箱，外送检测血肌酐。 1.5.2 肾组织染色评定肾小球硬 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 化指数评分与肾小管间质损伤评分 取 左侧肾脏，冲洗，去包膜，常规固定、 脱水、透明、浸蜡、包埋，制成 3 m 切片，行 HE、Masson 染色。光镜下各 选 20 个视野行肾小球硬化指数评分与 肾小管间质损伤评分4。肾小球硬化指 数评分按正常、轻、中、重度分为 03 级。肾小球硬化指数评分 =（1n1+2n2+3n3）/每片肾小球总 数100%。n1 n3 为 1 3 级肾小球个 数。肾小管间质损伤评分分别按正常、 轻、中、重度为 03 级，相应记为 03 分。 1.5.3 免疫组化法检测 MMP- 2、TIMP-2 切片烤片，脱蜡，水化；热 修复后冷却；PBS 冲洗；加 3% H2O2 去离子水，室温孵育 20 min，PBS 冲洗； 滴加稀释一抗（抗 MMP-2、抗 TIMP- 2） ，4过夜；室温 20 min，PBS 冲洗； 滴加聚合物辅助剂，孵育 20 min，PBS 冲洗；滴加辣根酶标记抗山羊 IgG 聚合 物，37孵育 20 min，PBS 冲洗；DAB -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 显色，镜下观察细胞着色，常规脱水、 透明、封片。采用 Image-Pro P1us 6.0 专业图像分析软件，比较各组平均光密 度值。 1.6 统计学方法 运用 SPSS 20.0 软件，正态分布 计量资料以均数标准差（xs）表示， 采用单因素方差分析，组间两两比较采 用 LSD 法。以 P 0.05 为差异有统计学 意义。 2 结果 2.1 光镜改变 2.1.1 HE 染色 假手术组：肾组 织结构清晰，肾小球和肾小管结构正常， 肾间质无炎症细胞浸润。模型组：肾小 管结构明显破坏，小管上皮细胞大量脱 落、坏死，小管显著萎缩，肾间质大量 炎症细胞弥漫性浸润，小球系膜细胞增 生，肾小球硬化。药物组：肾组织病变 较模型组减轻，小管基底膜相对完整， 小管上皮细胞部分空泡变性，炎症细胞 浸润减轻，肾小球轻度硬化。见图 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 1（封三） 。 2.1.2 Masson 染色 假手术组：肾 组织结构清晰，肾间质无纤维组织增生。 模型组：皮髓质胶原纤维广泛沉积。药 物组：胶原纤维增生较模型组减轻。见 图 2（封三） 。 2.2 病理评分 模型组和药物组肾小球硬化指数 及肾小管间质损伤评分均显著高于假手 术组（P 0.01） ，而药物组肾小球硬化 指数及肾小管间质损伤评分低于模型组 （P 0.01） 。见表 1。 注：与假 手术组比较，*P 0.01；与模型组比较， #P 0.01 2.3 血肌酐、24 h 尿蛋白 与假手术组比较，模型组和药物 组血肌酐、24 h 尿蛋白升高（P 0.01） ； 与模型组比较，药物组血肌酐、24 h 尿 蛋白降低（P 0.01） 。见表 2。 2.4 MMP-2 、TIMP-2 的表达 MMP-2 、TIMP-2 阳性表达主要 在肾间质细胞胞浆，肾小球少量表达。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 假手术组均呈弱阳性表达；模型组 MMP-2 呈阳性， TIMP-2 呈强阳性；药 物组 MMP-2 呈强阳性， TIMP-2 呈阳性。 见图 34（封三） 。 2.5 MMP-2 、TIMP-2 的光密度值 与假手术组比较，药物组与模型 组 MMP-2、 TIMP-2 表达均增高（P 0.01） ；与模型组比较，药物组 MMP-2 升高，TIMP-2 降低（P 0.01） 。见表 3。 3 讨论 散结通络方是本课题组针对缺血 性肾病晚期病变研制的复方，依据临床 2及实验研究5-6，结合络病理论7， 提出了缺血性肾病基本病机为肾络损伤， 肾络绌急，进而肾络郁滞、瘀阻、瘀塞 致肾络微型Y 瘕。病初肾络郁滞，脉 络郁滞致脉络瘀阻。肾络瘀塞为肾络绌 急、瘀阻发展致肾络阻塞血流中断，形 成肾络微型Y 瘕。 “不通”为贯穿始终 的病理变化，故治疗以“ 通 ”为用，本研 究针对病变晚期肾络瘀塞形成肾络微型 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 Y 瘕病机，治法以破瘀消 Y、散结 通络为主。方中黄芪、当归、党参为益 气补血之佳品，改善肾络气血中断之不 足。 “血中气药 ”川芎营气助血，活血祛 瘀，破除脉络瘀阻，改善气血壅滞。地 龙搜风通络，更助气血运行。熟大黄泻 火解毒力缓，不伤正气。海藻、牡蛎消 Y 散结，与莪术、夏枯草配伍共奏散 结通络、清热排毒之效。 缺血性肾病晚期病变以肾间质纤 维化（renal interstitial fibrosis，RIF ）为 主要病理表现3。本研究中，模型组术 后 28 d 时肾组织病理改变与之符合，且 血肌酐及 24 h 尿蛋白定量明显增高，以 上病理改变及生化指标提示本研究造模 成功。研究发现，RIF 与细胞外基质 （ECM ）过度沉积和降