胡桃楸总鞣质的小鼠体内抗肿瘤作用研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 胡桃楸总鞣质的小鼠体内抗肿瘤作 用研究 摘要 目的 研究胡桃楸 鞣质 的体内抗肿瘤活性。 方法 采用 70%丙 酮超声提取胡桃楸中总鞣质。采用荷 H22 肝癌实体瘤小鼠模型评价胡桃楸的 抗肿瘤活性。将 50 只 ICR 小鼠随机分 为正常组，模型组，环磷酰胺阳性对照 组，总鞣质低、高剂量组，每组各 10 只。正常组小鼠右腋下接种 PBS（0.2 mL/只） ，其余各组小鼠均于右腋下接种 等体积的小鼠 H22 肝癌细胞悬液 （2106 个/mL） 。接种 24 h 后给药，总 鞣质低（0.09 g/kg） 、高剂量（0.18 g/kg）组分别灌胃给予低浓度和高浓度 的总鞣质提取物，阳性对照组腹腔注射 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 环磷酰胺生理盐水溶液（0.03 g/kg） ，正 常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水。 连续给药 10 d 后，处死小鼠，以瘤重和 抑瘤率为指标研究胡桃楸总鞣质对 H22 肝癌实体瘤的抑制作用，以免疫器官指 数、外周血象和肝功能为指标研究胡桃 楸总鞣质对荷瘤机体生存质量的影响。 结果 胡桃楸总鞣质的得率为 5.07%， 纯度为 92.8%。与模型组比较，胡桃楸 总鞣质低、高剂量组肿瘤重量明显降低 （P 中国论文网 /6/view-12874478.htm 关键词 胡桃楸；总鞣质；小鼠 肝癌；抗肿瘤 中图分类号 R285.5 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2017） 01（c）-0016-04 Abstract Objective To evaluate the in vivo anti-tumor activity of the total tannins from Juglans mandshurica. Methods Total tannins from Juglans mandshurica was extracted by 70% acetone. Mice bearing murine- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 hepatocarcinoma （H22） model was established to evaluate the anti-tumor activity. Totally 50 ICR mice were randomly divided into five groups with 10 mice in each group： normal control group， model control group， cyclophosphamide group （as positive control） ， and total tannins low， high dose group. The normal control group was subcutaneously injected with PBS （0.2 mL per mouse） ， while the other four groups were subcutaneously injected with murine-hepatocarcinoma （H22） cell suspension （2106/mL ）. 24 h after injection， total tannins low， high dose group was intragastrically administered with total tannins at low （0.09 g/kg） and high dosage （0.18 g/kg）. Cyclophosphamide group was given with cyclophosphamide （0.03 g/kg） by intraperitoneal injection. Normal and model control groups were intragastrically -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 administered with water. After continuous administration for 10 d， killed mice， tumor weight and tumor inhibition ratio were obtained for the evaluation of the anti-tumor activity. Immune organ index， hematological parameters and Hepatic functions were determined to estimate the protective effects of total tannins on normal functions of H22 tumor bearing mouse. Results The yield of tannins from Juglans mandshurica was 5.07%， and the purity of the tannins was 92.8%. Total tannins from Juglans mandshurica showed inhibitory effect on the growth of tumor tissues. The inhibitory ratio of total tannins low and high dose group were 34.22% and 36.92%， respectively. Total tannins from Juglans mandshurica did not exhibit side effects， which are typical of cyclophosphamide， such as loss of body weight， immune suppression and killing white blood cell. Conclusion Total tannins -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 from Juglans mandshurica was effective in anti-tumor， and did not exhibit side effects of immune suppression and killing white blood cell. Key words Juglans mandshurica； Total tannins； Murine-hepatocarcinoma； Anti-tumor activity 胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim.）为胡桃科（Juglandaceae）植 物，属落叶乔木，在我国东北和华北地 区资源丰富。根据文献记载，胡桃楸具 有补肺益肾、滋阴助阳和抗癌等功效1- 2，民间采用胡桃楸的水煎剂治疗肿瘤 3。胡桃楸中主要含有鞣质和萘醌类成 分4-6 ，但是经过加热后，其中的萘醌 类成分多已挥发7，水煎剂中主要含鞣 质类成分。有学者研究表明，胡桃楸中 的鞣质类化合物前体没食子酸8和逆没 食子酸9能够抑制肿瘤细胞的增殖。因 此，本实验制备了胡桃楸总鞣质提取物， 研究了胡桃楸总鞣质的抗肿瘤作用，为 胡桃楸的抗肿瘤药效物质基础研究奠定 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 试药 胡桃楸枝样品于 2011 年 7 月采自辽宁省普兰店市莲山镇，由 辽宁中医药大学翟延君教授通过原植物 形态和性状特征鉴定为胡桃科植物胡桃 楸 Juglans mandshurica Maxim.。标本编 号 201107ZHI01，保存于辽宁中医药大 学研发中心 F205。 阳性对照环磷酰胺 （cyclophosphamide）纯度98%，购于 大连美仑生物，批号 20130326。 1.1.2 实验动物和瘤株 SPF 级 ICR 小鼠， 68 周龄，体重（1822 g） ，雌雄各半，购于大连医科大学实验 动物中心，合格证号：SCXX（辽） 2012-0002。饲养于本实验室动物饲养 室，环境温度 2025、湿度 40% 60%。 H22 小鼠肝癌瘤株购自南 京凯基生物科技发展有限公司。 1.1.3 仪器和试剂 胎牛血清、 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 PBS 缓冲液和 RPMI-1640 培养基购自 美国 Gibco 生命技术有限公司。 ALPHA1-4LSC 冷冻干燥机购自德国 Marin christ 公司，YXQSG46-280 压力 蒸汽消毒器购自宁波久兴医疗器械有限 公司，HD2-BCN-1360B 生物洁净工作 台购自哈尔滨东联电子技术有限公司， NUAIRE AUTOFLOW CO2 培养箱购自 美国纽艾公司。BC-2600vet 全自动血液 分析仪购自迈瑞公司，7020 全自动生化 分析仪购自株式会社日立制作所。 1.2 方法 1.2.1 胡桃楸总鞣质的制备 胡桃 楸茎枝切片后冷冻干燥、粉碎、过 40 目筛。取胡桃楸茎枝粉末 100 g 于锥形 瓶中，加 10 倍体积的 70%丙酮，超声 提取 40 min，冷凝水维持水温 20， 滤过，滤液转移至圆底烧瓶中，回收溶 剂至无丙酮味，冷冻干燥。密封保存于 4冰箱中。临用前用蒸馏水配置成低 （9 mg/mL） 、高（18 mg/mL）2 种不同 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 浓度的溶液。 1.2.2 胡桃楸总鞣质纯度的测定 精密称取胡桃楸总鞣质提取物 25 mg， 置 25 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻 度，作为供试品溶液。按照本课题组建 立的方法10 分别测定供试品溶液中总 多酚和游离多酚的含量，计算总鞣质的 含量。从而计算胡桃楸总鞣质提取物的 纯度。 1.2.3 小鼠 H22 肝癌实体瘤模型 的建立 取-80下冻存的 H22 小鼠肝癌 细胞，按常规方法进行复苏和小鼠体内 传代培养。无菌条件下剖取体内传至第 四代，接种 7 d 生长良好的 H22 肝癌小 鼠腹水，用 PBS 稀释 9 倍后计数，台酚 蓝拒染法测定细胞活性，活细胞率95%， 并根据计数结果调整离心管中的腹水浓 度，使细胞浓度为 2106 个/mL。吸取 细胞悬液，以 0.2 mL/只注射于小鼠右 腋下11-12。 1.2.4 分组和给药 接种 24 h 后， 将小鼠完全随机分为 4 组，每组 10 只。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 模型组灌胃给予蒸馏水，总鞣质低 （0.09 g/kg） 、高（0.18 g/kg）剂量组分 别灌胃给予低浓度（9 mg/mL）和高浓 度（18 mg/mL）的总鞣质提取物，阳性 对照组腹腔注射环磷酰胺生理盐水溶液 （3 mg/mL） 。另设 10 只右腋下注射 0.2 mL/只 PBS 的 ICR 小鼠作为正常组，灌 胃给予蒸馏水。各组小鼠分笼喂养，自 由饮水与摄食，每天给药 1 次，灌胃和 腹腔注射体积均为 10 mL/kg，连续给药 10 d。 1.2.5 血液样品的处理 末次给药 24 h 后，称小鼠体重，眼眶静脉丛采血。 在采集的过程中将其分成两部分：约 0.1 mL 静脉血收集于吸附有 EDTA-二 钾的 EP 管，做为抗凝血；剩余血液直 接收集于 EP 管中，做为非抗凝血。 抗凝血检测小鼠白细胞数目、血 小板数目和血红蛋白含量等血象指标。 非抗凝血静置 30 min，37水浴孵育 30 min，850 转/min，离心 10 min，用 移液枪吸取血清，检测各组小鼠血清中 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 蛋白、白蛋白和碱性磷酸酶等肝功能 指标。 1.2.6 组织样品的收集与处理 小 鼠采血后，颈椎脱臼处死，剥离肿瘤， 剖取胸腺、脾脏，称量各组织重量并记 录。计算各组抑瘤率、10 g 体重胸腺指 数和 10 g 体重脾脏指数。计算方法如下： 抑瘤率（%）= （模型组瘤重 -实 验组瘤重）/模型组瘤重100%， 胸腺指数=10胸腺重（mg）/体 重（g）100% ， 脾脏指数=10脾脏重（mg）/体 重（g）100% 。 1.3 统计学方法 采用统计软件 SPSS 19.0 对数据 进行分析，正态分布的计量资料以均数 标准差（xs ）表示，多组间比较采用 方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验。 以 P 0.05） 。模型组小鼠的脾脏指数略 高于正常组，但差异无统计学意义（P 0.05） ，胡桃楸总鞣质低、高剂量组小鼠 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 的脾脏指数也与正常组无统计学意义差 异（P 0.05） 。 实验结束时，阳性对照组小鼠的 体重降低（表 1） ，其余各组小鼠体重均 正