安全生产-食品质量安全检测新技术教材(ppt 186页)

食品质量安全检测新技术 讲课教师： 谢远红 课程主要内容 一 .现阶段存在的食品质量安全问题 二 .食品质量安全问题中检测技术 一 . 现阶段存在的食品质量安全问题 1. 转基因食品的安全性 2. 食源微生物的安全性 3. 生物毒素的安全性 4. 食品原料中农药、兽药残留的安全性 5. 抗生素、激素与有害物质残留 转基因食品的安全性 转基因食品的概念 “转基因 ” 是指利用分子生物学手段将外源 性基因转移到某种特定生物体中，使其生 物性状或机能发生部分改变。 转基因食品 （ genetically modified foods, GM食品）： 就是以转基因生物体直接作为 食品或以其为原料加工生产的食品 。 转基因食品的发展史 n 转基因食品的发展历史实际上就是基因工程、转 基因技术等生物技术的发展史。 n 1982年 ， 将大鼠生长激素重组基因导入小鼠受精 原核内，获得了人类历史上第一个转基因动物 转基因 “超级鼠 ”，比一般的小白鼠大一倍。 n 1983年 ，世界上第一例转基因植物（一种含有抗 生素药类抗体的烟草）在美国成功培植。 n 1994年 ，孟山都 (Monsanto)公司下属 Calgene公司 研制的 延熟保鲜转基因番茄 在美国批准上市，这 是发达国家批准商业化的第一个转基因作物。 转基因棉花 中国的转基因羊 日本研发的转基因大豆 各种各样的转基因水果 浙江省种植的转基因油菜 自 1996年，转基因农作物获得批准进入田间 试验以来，全球转基因作物研发和产业迅猛发展 ，创造了巨大的经济、社会和生态效应。从此， 世界上陆续有国家批准转基因作物的种植，转基 因作物的种植面积、种类以及商业效应更是逐年 攀升，这就是转基因作物的商业化种植。自 1996 年转基因作物首次商业化以来，转基因作物面积 累计达到近 10亿公顷，增长了 80倍。 n 转基因农作物的种植是现代农业发展的重要手段和重要领 域。 2010年国际农业生物技术应用组织服务（ ISAAA） 在北京发表 2009年度全球生物技术 /转基因作物商业化发 展态势报告，认为全球第二轮生物技术发展浪潮已经开始 。 ISAAA报告认为，去年全球生物技术发展一个最显著的 进步是中国一项里程式的决策 转基因抗虫水稻 和 植酸 玉米 获得生物安全发展证书。水稻和玉米分别是世界上最 重要的粮食作物和饲料作物，因此，对二者的生物安全的 认证对未来转基因作物在中国、亚洲乃至全世界的推广有 巨大的影响。 n ISAAA报告显示，去年 25个 国家的 1400 万 农民种植了 1.34亿 公顷转基因作物，面 积较上一年增长了 7%，其中 90%来自发 展中国家的小型农户。性状面积或 “实际面 积 ”达到 1.8亿 公顷，比 2008年增长了 1400万 公顷。 n 美国（ 6400万 公顷）、巴西（ 2140万 公 顷）、阿根廷（ 2130万 公顷）分列转基因 作物种植面积的前三位，中国（ 370万 公顷 ）列第六位。 n 截止 2008年底，我国已经批准 22 种 国外转基因 作物进口许可证，分别是转基因大豆 GTS-40-3- 2，转基因玉米（ Mon810， Bt11， Bt176， Mon863， NK603， GA21， T25， MON59122， TC1507， MON88017），转基 因油菜（ Ms1Rf1、 Ms1Rf2、 Ms8Rf3、 GT73 、 T45、 Oxy235、 Tapos19/12）和转基因棉 花（ Mon531、 Mon1445、 Mon15985、 Mon88913）。 n 20012008 年，中国进口转基因大豆累 计超过 2 亿吨。在中国市场上 70%的大豆 制品中含有转基因成分，像大豆油、色拉 油、磷脂、酱油、膨化食品等等，进入中 国消费者的生活转基因食品主要是使用转 基因大豆加工的食用油和豆制品。另外在 市场上发现转基因米粉、饼干、咖啡等， 中国正在接受更多的国外转基因食品。 羞羞答答的转基因大豆油 转基因植物的构建策略 作物转入的外源基因的类型及方法 n 类型： 转基因作物涉及的遗传改良性状主要包括： 抗除草 剂基因 占总面积的 71%， 抗虫基因 占 28%， 抗病毒基因 占 1%。 n 方法： 农杆菌介导法： 农杆菌中有一种致瘤的环型 DNA， 称为 Ti质粒。被农杆菌感染的植物之所以长瘤正是由于 T DNA 插入了植物染色体。从此，人们便利用这种天然的 转化体系向植物转基因。 基因枪： 把所要转入的基因包被 在金粉或钨粉上之后，利用基因枪将其打入培养细胞中来 完成转基因过程。 转基因大豆 转基因大豆的研究主要以耐除草剂和改善大豆品质为主： n 耐除草剂： 在美国有 3个转基因大豆品种已应用，最多的 是对除草剂 草丁膦 和 草甘膦 具有耐性的个品种。 2002年 种植面积占美国大豆的 74%。 可见，目前美国的大豆生产 已经基本上普及了耐除草剂的转基因品种。 n 改善大豆成分： Mazur等 (1999) 获得了 种子油酸 相对含量 高达 85%的大豆新品系，而且农艺性状优良。 转基因玉米 转基因玉米的研究主要集中于提高 抗虫性 和 耐除草剂 方面。 n 在美国，转基因玉米的种植面积占玉米总种植面积的比例 在 35% 左右。 n 其中 抗虫 Bt玉米 的种植面积发展最快，所占近比例最大， 2002年约占玉米种植总面积的 24 ； 耐除草剂 玉米占 7 10 之间；兼具抗虫和耐除草剂特性的转基因玉米品种 种植规模仍然不大，近年来仅占玉米种植总面积的 1 -2 。 转基因水稻 转基因水稻的研究主要集中在 以下三个方面： n 提高光合效率： 将 C4作物玉米的 PEPC基因导入水稻的基 因组，从而改良了水稻的 光合作用效率 。 n 提高营养品质： Ye等（ 2000）成功地将来自其他物种的 psy、 cntl和 lcy基因整合到水稻基因组中，解决了水稻胚乳 不能合成 维生素 A的难题。 n 增加抗逆性： 纽约康乃尔大学的加戈等将大肠杆菌中两种 负责合成 海藻糖 的基因导入到籼稻中。转基因水稻在恶劣 环境条件下的生存能力比普通水稻更强。 n 到底 我国 目前 有多少转基因食品 ？ 已经超过 2000万吨 。 n 目前我国极少生产粮食、油料作物等转基因食品 ，只有一些转基因抗虫棉，但并不进入人的食物 链。我国的转基因食品基本上都是进口的。 n 排在前三位的是：大豆、玉米、油菜。我国去年 进口大豆 3500万吨。目前我国进口大豆主要用做 加工原料，生产豆油、豆腐、豆奶等制品。 转基因食品的主要功能 1.改善食品品质和加工特性 2.提高农作物的抗病虫害性能 3.提高果蔬产品的耐储存性和保鲜期 4.改善发酵食品品质和风味 5.改良动物性食品品质 转基因作物的利与弊 n 转基因作物的带来的效益 ISAAA报告认为，转基因作物已经在以下几个重要方面做出 了贡献： （ 1）保证粮食安全，保证粮食价格的稳定，解决发展中国 家人民的饥饿问题。世界人口数量，特别在发展中国家， 还在持续增长，它带来的粮食短缺问题，也就成为了一个 全世界关注的重要问题。因此，通过基因工程技术，特别 是转基因技术，以获得高产的优良农作物品种，可能将是 解决 21世纪不断增加人口对粮食需求的重要途径之一。 （ 2）创造了明显的可观的经济效益。转基因农作物的发展 能够带来明显的经济效益，如加拿大，在 1996年种植了 1200万 hm 耐除草剂油菜后，产量提高 9 ，经济效益 达 600万美元；中国种植转基因抗虫棉花，从 1997 2000年的 4年，总的经济效益达 3 37亿美元。在 2000 年世界转基因作物产品的价值为 3O亿美元，预计 2010年 时价值可达 800亿美元。由此可见，经济效益是十分明显 的。 转基因食品的安全性 1.未进行较长时间的安全性试验 ：基因化食品改变了我们所 食用食品的自然属性，它所使用的生物物质不是人类食品 安全提供的部份，未进行长时间的安全试验，无法确定这 类食品是否安全。 英国一位科学家在著名医学杂志 柳叶刀 上发表论文，宣称实验用 的大鼠在食用转基因马铃薯以后，肝脏受到损伤，免疫系统受到削弱 ，由此掀起了国际社会对转基因食品安全性广泛争论的序幕。 对人类健康产生的安全性问题 2 产生毒素 ：基因化食品能产生不可预见的生物突变，会在 食品中产生较高水平和新的毒素。 Losey,J.E.等（ 1999） 报道，在一种植物马利筋叶片上撒有转基因 Bt玉米花粉后 ，普累克西普斑蝶食用叶片就少，长得慢， 4天的幼虫的 死亡率 44%。而对照组（饲喂不撒 Bt玉米花粉的叶片）无 一死亡。转基因作物产生的杀虫毒素可由根部渗入周围， 但尚不清楚会产生何种影响，是否会对人类的健康产生影 响同样未知。 3 过敏或变态反应 ：基因技术会在食品中产生不能预见 的和未知的变态反应原。据报告，对巴西坚果产生过 敏的主体也会对用该坚果基因工程化而得到的大豆产 生过敏。科学家把巴西胡桃的特性移植到黄豆上去， 结果却使一些对胡桃过敏的人在摄取黄豆时有过敏的 可能。植物凝血素（ Lectin）对有些害虫来说是有毒的 ，转基因食品不得含有此类有毒物质。 4 减少食品的营养价值或降解食品中重要的成份 ：基因化的 目的是去除或灭活人们认为不需要的物质，这些物质可能 是未知的。美国的研究资料表明，在具有抗除草剂基因的 大豆中，异黄酮类激素等防癌的成份减少了。具有芳香、 有光泽的红色蕃茄能贮藏几周，但营养价值较低。消费者 在购买水果或蔬菜时，仅依靠外观和质地，因此，不能准 确判定该产品的真实质量。 5 产生抗菌素耐药性细菌 ：基因技术采用耐抗菌素（如抗卡 那霉素、氨苄青霉素、新霉素、链霉素等）基因来标识转 基因化的农作物，这就意味着农作物带有耐抗菌素的基因 。荷兰科学家发表在 新科学家 杂志的试验结果称，设 计一人造胃，对人消化转基因食物的过程进行模拟，发现 DNA滞留在肠内，同时一些转基因细菌能够把自己的抗生 素抗性基因转移给人造胃的细菌。 6. 副作用能对人体产生危害 ： Mayeno,A.N.等（ 1994）报告 ，发生一种新的，不明原因的病症，主要表现为嗜酸性肌 痛。临床表现有麻痹、神经问题、痛性肿胀、皮肤发痒、 心脏出现问题，记忆缺乏、头痛、光敏、消瘦（ Brenneman,D.E.等， 1993； Love,L.A.等， 1993）。后查 明系日本一公司生的基因化工程细菌产生的色氨酸所致。 食用者在 3个月后发病，导致 37人死亡， 1500人体部份麻 痹， 5000多人发生偶尔性无力。据测定，含量为 0.1%便 可杀死人体。 1 除草剂使用的增加 ：科学家估计，基因化的农作物对除草 剂具有抵抗力，实际应药量高于正常的 3倍。农民知道其 作物对除草剂有抵抗力，会大量使用除草剂。 2 杀虫剂使用的增加 ：农作物常使用自己特有的杀虫剂，基 因化的农作物对杀虫剂有抵抗力，这就意味着比以前有更 多的杀虫剂进入我们的食品和田野。有报导，将优良的特 定的基因（如抗杀虫剂）植入作物，可能会使周围野生植 物一并获得改良，呈现出抗杀虫剂的特征。 对环境产生的安全性问题 3 基因污染 ：转基因作物通过基因流可使野生近缘种变为 杂草，成为 “超级杂草 ”。有资料证明，把转基因油菜释放 后，当大田的油菜附近有近缘杂草时，在萌发的后代种子 中有 93%被证实是种间杂草。 4 对非目标生物有伤害，对生物多样性形成威胁 ： Birch,A.等（ 1996/7）的实验结果表明，用转基因马铃 薯饲喂蚜虫，雌虫的产卵量减少 1/3，用喂转基因马铃 薯长大的雄蚜虫与对照组蚜虫交配，所得的未受精卵 数量多 4倍，已受精卵在未孵化前比对照组死亡率高近 3倍，以转基因马铃薯蚜虫为食物的雌飘虫的存活时间 比对照组少一半，如果大规模的种植转基因作物，可 能会减少有益昆虫的种群。 转基因食品的检测技术 转基因植物产品的安全性评估极为重要，但可能更为受 到人们关注的是转基因产品的检测技术。目前要测试植物 产品是否含有基因改造成分，或植物产品是否经过基因改 造，主要有两种方法： 1 检测是否有外来基因或 DNA； 2 检测是否有外源的蛋白质 。 制订了 12项转基因产品检测行业标准和 7项国家标准； 研制并生产了 10种转基因产品检测试剂产品；建立了转基因 产品检测信息库和一个转基因产品信息网站。 n 大豆中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 n 玉米中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 n 油菜籽中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 n 烟草中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 n 植物性 饲 料中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 n 马铃 薯中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 n 棉花中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 食源微生物的安全性 时间 微生物名称 食品源 感染人数 国家 1984 鼠伤寒沙门氏菌 沙拉酱 美国 1985 鼠伤寒沙门氏菌 巴氏消毒奶 170 000 美国 1989 金黄色葡萄球菌 蘑菇罐头 美国 1991 甲肝病毒 毛蚶 300 000 中国 1994 肠炎沙门氏菌 巴氏消毒液态冰激凌 224 000 美国 1996 大肠杆菌 O157:H7 萝卜 8 000 日本 1997 肠炎沙门氏菌 蛋和肉制品 2013 比利时 2000 金黄色葡萄球菌 雪印牛奶 日本 2001 单增李斯特菌 法国 世界上食源微生物感染群发事件 根据 WHO估计： 发达国家食源性疾病的漏报率在 90%以上 发展中国家食源性疾病的漏报率 95%以上 “冰山一角 ” 沙门氏菌 （禽、畜肉） 副溶血性弧菌 （水产品） 蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌 （剩饭） 肉毒梭菌 （发酵制品、肉制品） 单核细胞增生李斯特菌 （乳制品、冷藏食品） 大肠杆菌 O157:H7（ 肉制品）等。 微生物性食物中毒常见的致病菌和食物： 方法修订征求意见文本 n GB4789.2 菌落总数测定 n GB4789.3.1 大肠菌群测定 n GB4789.3.2 粪大肠菌群测定 n GB4789.3.4 大肠杆菌检验 n GB4789.10.1 金黄色葡萄球菌定性检验 n GB4789.10.2 金黄色葡萄球菌定量检验 生物毒素的安全性 也称作 真菌毒素 （ Mycotoxins） Mykes: Greek for fungus/mold 希腊 语 “霉菌 ” Toxicum: Latin for poison/toxin 拉丁文 “毒素 ” 真菌毒素（ Mycotoxin）， 有时也俗称霉菌毒素，是某些 真菌产生的代谢产物，目前已发现的真菌毒素有十多种， 它们包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马霉素、脱氧雪腐 镰刀菌烯酮（也称为呕吐毒素）、玉米赤霉烯酮、 T-2毒 素、麦角碱、杂色曲霉素、黄米毒素、岛青霉毒素、展青 霉毒素（棒曲霉毒素）、橘青霉素、皱褶青霉素、黄绿青 霉素、红矢精、黄绿素、圆弧青霉偶氮酸和 F-2毒素等。 能够产生真菌毒素的霉菌 1） 曲霉属 （ Aspergillus Link）：黄曲霉（ A. flavus）、 寄生曲霉（ A. parasiticus）、赭曲霉（ A. ochraceus） 、杂色曲霉（ A. flavus）、烟曲霉（ A. flumigatus）、 构巢曲霉（ A. nidulans）和棒曲霉（ A. clavus）等。 2） 青霉属 （ Penicillium Link ex Fr）：岛青霉（ P. islandicum）、橘青霉（ P. citrinum）、红色青霉（ P. rubrum）、展青霉（ P. patulum）和黄绿青霉（ P. citreo-vinide）等。 3） 镰刀菌属 （ Fusarium Link ex Fr）：禾谷镰刀菌（ F. graminearun）、串珠镰刀菌（ F. moniliforme）、木 贼镰刀菌（ F. equiseti）、茄病镰刀菌（ F. solani）、 三线镰刀菌（ F. tritinctum）和镳草镰刀菌（ F. sporotrichioides）等。 玉米上的曲霉属（ Aspergillus) 玉米上的镰刀菌属（ Fusarium ) 玉米上的赤霉素（ Gibberella ) Aflatoxin 黄曲霉毒素 n Produced by Aspergillus flavus and A. parasiticus 由 黄曲 霉和寄生曲霉产生 n Five key aflatoxins (五种 黄曲霉毒素 ): B1, B2, G1, G2 and M1 n Found in corn, grains, cottonseed, peanuts, tree nuts, spices, milk 玉米、 谷物、棉籽、花生、坚果、调味品、牛 奶中均已发现 n Liver damage 对 肝有损害 n IARC- class 1 human carcinogen 国际 肿瘤研究机构定为 一级致癌物 黄曲霉毒素的化学性质 黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，在 紫外线下，黄曲霉毒素 B1、 B2发兰色荧光，黄曲霉毒 素 G1、 G2发绿色荧光。黄曲霉毒素 M1是黄曲霉毒素 B1在 体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的分 子量为 312-346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和 氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。 一般在中性及酸性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中 稍有分解，在 pH 9-10的强碱溶液中分解迅速。其纯品 为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素 B1的分解温度为 268 oC， 紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。 黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况 (1) 商 品 国 家 文献 发 表年份 被分析的 样 品数 出 现 率 （ %） 含量范 围 (g/kg) 玉米 印度 1997 2074 47 5-666 玉米 阿根廷 1996 2271 20 5-560 花生 印度 1996 2062 45 5-833 花生粉 印度 1995 380 97 8-6280 棉籽粉 英国 1997 21 71 5-25 干椰子粉 菲律 宾 1995 9 100 23-186 巴西果 美国 1993 176 17 0-619 Pistachio果 芬 兰 1996 29 59 2-165 黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况 (2)商 品 国 家 文献 发 表年份 被分析的 样 品数 出 现 率 （ %） 含量范 围 （ g/kg ） 杏仁 美国 1993 44 1 0-372 大豆 阿根廷 1991 94 10 1-36 大米 厄瓜多 尔 1997 99 9 7-40 小麦 乌 拉圭 1996 123 20 2-20 干无花 果 奥地利 1993 136 13 1-350 肉豆 蔻 日本 1993 67 43 0-17 Chillies 果 巴基斯 坦 1995 176 66 1-80 Aspergillus flavus黄曲霉 五颗表面消毒的花生 置于营养培养基中， 其中两颗有长出黄曲 霉（黄绿色霉菌） 黄曲霉毒素 的毒害作用 黄曲霉毒素对天竺鼠肝脏的影响，从上排的最左边到下排的最 右边，同一时间内摄入的黄曲霉毒素量逐步增加。请注意：摄 入的黄曲霉毒素量越大，天竺鼠肝脏越苍白。 黄曲霉毒素的毒性 1.一级致癌物质。 2.是氰化钾的 10-20倍。 3.是 砒霜的 68倍 。 4.是农药 1605、 1059的 28-33倍。 5. 是 3， 4-苯并芘的 4000倍。 6.是二甲基亚硝胺的 75倍。 黄曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒症（ 一） 动 物 年 龄 黄曲霉毒素 (mg/kg.bw) 喂 饲 时间 毒性作用 小牛 断乳 0.22-2.2 16周 发 育 迟缓 、死亡、肝 损伤 小公牛 2岁 0.22-0.66 20周 肝 损伤 奶牛 2岁 2.4 7个月 肝 损伤 鸭 0.234 6周 肝 损伤 、死亡 黄曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒症 （二） 动 物 年 龄 黄曲霉毒素 (mg/kg.bw) 喂 饲 时间 毒性作用 猪 新生 0.234 4天 发 育 迟缓 猪 2周 0.17 23周 厌 食、黄疸、腹水、 发 育 迟缓 猪 4-6周 0.41-0.69 3-6 个月 发 育 迟缓 、肝 损伤 鸡 1周 0.84 10周 发 育 迟缓 、肝 损伤 鸡 2天 0.2 40天 长 瘤 Ochratoxin赭曲霉毒素 n Produced by Aspergillus ochraceus and Penicillium viridicatum 由 赭色曲霉菌 和 青霉菌 产生 n Found in cereal grains, coffee, pig products, dried vine fruit, wine可在 谷物、咖啡、猪肉产品、葡萄干和 酒中发现 n Nephrotoxin (kidney toxin)肾 毒素 n Linked to Balkan endemic nephropathy与 巴尔干肾病 有关 n IARCpossible human carcinogen 国际 肿瘤研究机构认定为 2B类致癌物 赭曲霉毒素的化学性质 包括 7种结构类似的化合物。其中赭曲霉毒素 A(R1=C1， R2=H)毒性 最大，在霉变 谷物 、 饲料 等最常见。 赭曲霉毒素 A是一种无色结晶化合物。可溶于极性有机溶剂和稀 碳酸 氢钠 溶液。微溶于水。其苯溶剂化物熔点 94 96 ， 二甲苯 中结晶熔点 169 。有很高的 化学稳定性 和 热稳定性 。赭曲霉毒素 A是由多种生长在 粮食 （ 小麦 、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、 花生 、 蔬菜 （ 豆类 ）等 农作物 上的 曲霉 和 青霉 产生的。动物摄入了霉变的饲料后，这种 毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害动物 肝脏 与 肾 脏 。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜 炎症和坏死。还在动物试验中观察到它的致畸作用。 赭曲毒素 A在各种商品中的存在情况（ 1） 商 品 国 家 文献 发 表 年份 被分析的 样 品数 出 现 率 （ %） 含量范 围 (g/kg) 大麦 德国 1998 67 97 25-27000 小麦 丹麦 1997 50 80 50-4550 黑麦 丹麦 1997 266 29 10-2124 燕麦 丹麦 1997 121 20 42-350 小麦 瑞士 1997 153 34 73-2395 大麦 /小 麦 英国 1997 240 56 50-34868 绿 咖啡 日本 1997 35 74 100-1740 赭曲毒素 A在各种商品中的存在情况（ 2） 商 品 国 家 文献 发 表年份 被分析的 样 品数 出 现 率 （ %） 含量范 围 (g/kg) 绿 咖 啡 英国 1997 22 50 50-5787 可可粉 英国 1996 50 100 225-37000 干果 英国 1996 48 98 600-37650 酒 德国 1996 64 89 550-6320 调 味 品 /本 草植物 德国 1996 317 27 6-7132 二 .食品质量安全问题中检测技术 n分子生物学检测技术 基因检测 免疫学检测 n化学检测技术 n 基因检测技术： 1. PCR法 2. 分子杂交法 3. 基因芯片法 PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的 类型和应用 多聚酶链式反应多聚酶链式反应 （ PCR： Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶聚合酶 PCR技术的创建技术的创建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）（穆利斯（美） Khorana(1971)等提出在体外经等提出在体外经 DNA变性变性 ,与适当引与适当引 物杂交物杂交 ,再用再用 DNA聚合酶延伸聚合酶延伸 ,克隆克隆 DNA的设想。的设想。 1983年年 ,Mullis发明了发明了 PCR技术技术 ,使使 Khorana的设想得的设想得 到实现。到实现。 1988年年 Saiki等将耐热等将耐热 DNA聚合酶（聚合酶（ Taq）引入了）引入了 PCR技术技术 1989年美国年美国 Science 杂志列杂志列 PCR 为十余项重大为十余项重大 科学发明之首科学发明之首 ,比喻比喻 1989年为年为 PCR爆炸年爆炸年 ,Mullis荣荣 获获 1993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。 生物样品生物样品 DNA片段片段 基因诊断基因诊断 基因治疗基因治疗 基因工程产品基因工程产品 法医学检测法医学检测 人类学研究人类学研究 PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要 引物 引物 Mullis 的构思的构思 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 特定特定 DNA片段片段 1983年 94 变性变性 50-65 退火退火 XX 延伸延伸 Taq DNA聚合酶（聚合酶（ thermus aquaticus) 酶酶 活性活性 (%) 温度温度 ( ) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 7294 55 PCR循环循环 PCR技术的原理技术的原理 1 PCR技术的基本原理技术的基本原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中无细胞分子克隆法：在微量离心管中 ,加入加入 适量的缓冲液适量的缓冲液 , 微量的模板微量的模板 DNA,四种脱氧单四种脱氧单 核苷酸核苷酸 ,耐热性多聚酶耐热性多聚酶 , 一对合成一对合成 DNA的引物的引物 , 通过通过 高温变性高温变性 、 低温退火低温退火 和和 中温延伸中温延伸 三个阶三个阶 段为一个循环段为一个循环 ,每一次循环使特异区段的基因每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍拷贝数放大一倍 ,一般样品是经过一般样品是经过 30次循环次循环 , 最终最终 使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍 ; 扩增了特异区扩增了特异区 段的段的 DNA带带 。 加热加热 变 变 性性 复复 性性 复 温 DNA的变性和复性的变性和复性 加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用 可以使可以使 DNA双螺旋的氢双螺旋的氢 键断裂键断裂 ,双链解离双链解离 ,形成形成 单链单链 DNA,这称为这称为 DNA的的 变性。变性。 解除变性的条件后解除变性的条件后 , 变变 性的单链可以重新结合性的单链可以重新结合 起来起来 ,形成双链形成双链 ,其原有其原有 的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复 , 这称这称 DNA复性复性 , 也叫退火也叫退火 。 PCR扩增原理扩增原理 引物引物 延伸延伸 延伸延伸 5 53 3 变性、退火变性、退火 变性、退火变性、退火 2 PCR技术的特点技术的特点 1 ）高度的灵敏性）高度的灵敏性 30轮循环轮循环 扩增量达扩增量达 230个拷贝个拷贝 PCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍 2 ）特异性）特异性 引物引物 引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定定 PCR反应结果的关键。反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩引物设计的最大原则是最大限度地提高扩 增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性 扩增。扩增。 引物设计：引物设计： （ 1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区 ,与非扩增区无同与非扩增区无同 源序列。源序列。 （ 2）引物长度以）引物长度以 18-30 bp为宜。为宜。 （ 3） 碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布 ,G+C占占 50-60%。 （ 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。 （ 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。 （ 6）引物）引物 3 端端 为为 关键碱基关键碱基 ； 5 端端 无严格限无严格限 制。制。 3）操作简便易行）操作简便易行 PCR扩增法扩增法 ,只需要数小时只需要数小时 ,就可以用电泳就可以用电泳 法检出法检出 1g 基因组基因组 DNA中仅含数个拷贝的模板中仅含数个拷贝的模板 序列。序列。 通常的通常的 DNA 扩增法是分子克隆法扩增法是分子克隆法 , 首先要首先要 构建含有目的的基因的载体构建含有目的的基因的载体 , 然后将它导入然后将它导入 细胞后进行扩增细胞后进行扩增 ,还要用同位索探针进行筛选还要用同位索探针进行筛选 ;这种方法这种方法 ,要经过要经过 DNA内切、连接、转化和培内切、连接、转化和培 养等相关的过程养等相关的过程 ,操作复杂操作复杂 ,一般需要数周时一般需要数周时 间。间。 4 ）用途广泛）用途广泛 生命学科生命学科 医学工程医学工程 遗传工程遗传工程 疾病诊断疾病诊断 法医学法医学 考古学考古学 PCR的反应体系和方法的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性 , 退火使引物与模板 DNA互 补 ,延伸需将反应温度升至中温 ( 72), 在 Tap多 聚酶 的作用下 ,以 dNTP为原料 ,以 引物 为复制的起 点 ,合成新链。 如此重复改变反应温度 ,即 高温变性、低温退火 和中温延伸 三个阶段为一个循环 ,每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大一倍 ,一般样品是经过 30 次循环 ,最终使基因放大了数百万倍 ; 将扩增产物 进行电泳 ,经溴化乙锭染色 ,在紫外灯照射下肉眼 能见到扩增特异区段的 DNA带。 总体积总体积 50-100 l Buffer 缓冲液缓冲液 dNTP 原料原料 Primer 引物引物 DNA分子分子 模板模板 Taq酶酶 DNA聚合酶聚合酶 1 反应体系反应体系 PCR技术的基本过程技术的基本过程 (1) 模板模板 DNA dNTP 引物引物 Buffer 预变性预变性 模板模板 DNA dNTP 引物引物 Buffer TaqDNA聚合酶聚合酶 94oC5 2 基本过程基本过程 PCR技术的基本过程技术的基本过程 (2) Taq 酶酶 模板模板 DNA dNTP 引物引物 Buffer 循循 环环 仪仪 94 55 72 Taq 酶酶 模板模板 DNA dNTP 引物引物 Buffer 72 5 7 min 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 PCR技术的基本过程技术的基本过程 (3) 1） PCR反应成分反应成分 （ 1） 模板模板 单、双链单、双链 DNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制聚合酶抑制 剂、剂、 DNA结合蛋白类。结合蛋白类。 一般一般 100ng DNA模板模板 /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 。 3 PCR反应条件反应条件 （ 2）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配 ,反应特反应特 异性下降。异性下降。 （ 3） Taq DNA聚合酶聚合酶 （ thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降 ;酶量过少影酶量过少影 响反应产量。响反应产量。 （ 4） dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种 dNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入 ,浓浓 度过低则降低反应产量度过低则降低反应产量 dNTP可与可与 Mg2+结合结合 ,使游离的使游离的 Mg2+浓度浓度 下降下降 ,影响影响 DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 （ 5） Mg2+ Mg2+是是 DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。 Mg2+浓度过低会使浓度过低会使 Taq酶活性丧失、酶活性丧失、 PCR产量产量 下降；下降； Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合可与负离子结合 ,所以反应体系中所以反应体系中 dNTP 、 EDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的 Mg2+浓度浓度 。 2）循环参数）循环参数 (1)变性变性 使双链使双链 DNA解链为单链解链为单链 94oC 20-30秒秒 (2) 退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和 GC含量决定。含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异增加温度能减少引物与模板的非特异 性结合性结合 ;降低温度可增加反应的灵敏性降低温度可增加反应的灵敏性 。 （ 3）延伸）延伸 70-75, 一般为一般为 72 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定 （ 4）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版 DNA的浓度的浓度 一般为一般为 25-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加 经典循环参数（ 500bp以内） 94 30s 55 45s 72 1min 94 5min 30次 72 7min 42 forever 1）不对称）不对称 PCR 目的：扩增产生特异长度的目的：扩增产生特异长度的 单链单链 DNA。 方法：采用方法：采用 两种不同浓度的引物两种不同浓度的引物 。分别称为限。分别称为限 制性引物和非限制性引物制性引物和非限制性引物 ,其最佳比例一般是其最佳比例一般是 0.010.5M, 关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组 DNA结构功能的研究结构功能的研究 PCR的类型的类型 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物 2)反向反向 PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的 DNA片片 段对某个已知段对某个已知 DNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。 可对可对 未知序列未知序列 扩增后进行分析扩增后进行分析 ,如探索邻接已知如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的的 克隆克隆 ,扩增基因文库的插入扩增基因文库的插入 DNA； 建立基因组步移文建立基因组步移文 库。库。 已知序列已知序列未知序列未知序列 未知序列未知序列 已知序列已知序列未知序列未知序列 未知序列未知序列限制酶限制酶 限制酶限制酶 连接酶连接酶 3）多重）多重 PCR（复合（复合 PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电电 泳泳 引物引物 1 2 3 4 1234 4） LP-PCR（ Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对引物进利用同位素、荧光素等对引物进 行标记行标记 ,用以直观地检测目的基因。用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分 病毒病毒 1 病毒病毒 2 病毒病毒 3 病毒病毒 4 标记引物标记引物 观察观察 PCR产物产物 5） 逆转录酶 聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 基因基因 mRNA 蛋白质多肽链蛋白质多肽链 6) 荧光定量荧光定量 PCR（ real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 ,对对 PCR产产 物进行标物进行标 记跟踪记跟踪 ,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程 ,结合相应结合相应 的软件可以对结果进行分析的软件可以对结果进行分析 ,计算待测样品的初始模板计算待测样品的初始模板 量。量。 荧光定量荧光定量 PCR仪仪 光定量光定量 PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测仪是一种带有激发光源和荧光信号检测 系统的系统的 PCR仪仪 ,通常配有电脑系统及相应的分析软件。通常配有电脑系统及相应的分析软件。 荧光定量实时荧光定量实时 PCR与普通与普通 PCR的比较的比较 实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控 ,能够实时地观察到产物的增能够实时地观察到产物的增 加加 ,直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合 ,提高了提高了 PCR反应反应 的特异的特异 性性 增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控全程监控 ,准确的算法进行定量准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便 ,无需跑胶无需跑胶 全新 4通道实时荧光定量 PCR仪 普通梯度 PCR仪 PCR技术的应用技术的应用 1) 基因克隆基因克隆 重组重组 DNA 质粒质粒 DNA 基因片段基因片段 大肠杆菌大肠杆菌 胰岛素胰岛素 重组体重组体 + 胰岛素胰岛素 基因基因 基因工程产品基因工程产品 5 5 Bam H I Bam H I Bam H I Bam H I GTCCGGAC CCTG CAGG GTCCGGACCCTG CAGG CCTG GGAC GTCC CAGG 质粒质粒 DNA 目的基因目的基因 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 2)基因检测基因检测 A 内源内源 性病变基因性病变基因 正常人A 病 人 A 正常人正常人 病病 人人 正正 常常 病病 人人 3）基因）基因 鉴定鉴定 女女 性性 男男 性性 Y引物引物PCR 男性男性 女性女性 PCR技术在食品安全检测中的应用 方法步骤： 1、运用化学手段对 DNA提取； 2、设计并合成引物； 3、进行 PCR扩增； 4、克隆并筛选鉴定 PCR产物； 5、 DNA序列分析。 转 基因食品的 检测 大豆中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 玉米中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 油菜籽中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 烟草中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 植物性 饲 料中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 马铃 薯中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 棉花中 转 基因成份定性 PCR检测 方法 原理： 标记基因的 PCR检测 1.报告基因 GUS 基因 荧光素酶 (LUC)基因 胭脂碱合成酶 (NOS)基因 GFP基因 2. 抗性基因 PCR技术在微生物学中的应用 一 . 微生物检测 1.常规 PCR检测 在 1992年 Rahn 等利用沙门氏菌的 invA基因设计了一对引物 , 第一次用 PCR的方法对沙门氏菌进行了检测试验。共检测了 630 株沙门氏菌 ,约 100多种血清型和 21个菌属的 142株非沙门氏菌 。结果显示 ,有两株没有检测出 ,检出率为 99.14%。 2.多重 PCR Cortez等（ 2006）用多重 PCR检测了家鸡屠宰场不同来源样 品中的鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和其他血清型的沙门氏菌 。其使用了 3对引物 ,分别来自沙门氏菌的 invA, pefA和 sefA 基 因。在检测的 288 份样品中 ,鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的 检出率为 62%,其他血清型的沙门氏菌为 10%。 3.巢式 PCR 巢式 PCR ( nesting PCR)是指先后用两套引物进行扩增的 PCR 技术 ,用内外两对引物先后扩增靶基因片段。通常是先用第 一套引物扩增 15 - 30个循环 ,再用已扩增的 DNA片段内设定的第 二套引物扩增 15 - 30个循环。由于第二套引物设计片段位于第 一套引物扩增的片段内 ,所以将第一套引物称为外引物 ,而把第二 套引物叫做内引物。巢式 PCR既可增加反应的物异性 ,又可得到丰 产的特异性靶序列 ,增加敏感性。巢式 PCR技术对微生物的检测和 单拷贝基因靶 DNA的扩增都是非常有效。 Hashimoto等（ 1995）基于编码 Vi抗体的基因序列改进了巢 式 PCR,所有的伤寒菌 (包括丙型副伤寒 )都能检出 , 灵敏度可以达 到单个细胞水平。 Prakash（ 2005）的研究设计了肠沙门氏菌 Typhi血清型菌株的 H12d特异引物对进行巢式 PCR,结果显示 ,该 巢式 PCR能够代替 Widal测试方法诊断伤寒症 。 4.荧光定量 PCR Nam等 10 建立和评价了 SYBR Green 1 实时 PCR特异 检测沙门氏菌的方法。用大小为 119 bp的 invA 基因作为检测靶 点 ,对 124 株沙门氏菌和 116株非沙门氏菌进行了检测。检测结 果显示 ,所有的沙门氏菌有 invA基因阳性条带 ,而非沙门氏菌均没 有扩增条带。 5. 热起动 PCR 热起动 PCR (Hot start PCR)指的是使 Taq DNA聚合酶只在 样品温度超过至少 70 时才发挥作用的 PCR。它是为提高反应的 特异性设计的。如所周知道 , Taq DNA聚合酶通常在比适宜温度 低得多的条件下仍有较强的活性 ,会导致非靶序列的扩增 ,影响 PCR反应的特异性。热起动可减少非靶序列的扩增 ,从而提高反应 的特异性。 Yang等（ 2006）设计了 12对引物进行多重 PCR,并使用了热 启动酶 ,检测腊样芽孢杆菌毒素基因。该体系成功的检测出了与食 物中毒及与食品相关的 162株菌中潜在的毒素。 二 .微生物分类鉴定 在酿造工业中，对于保持发酵持久度的一致性和全体产品质量 的一致性来说，从非酿酒酵母菌株中纯化酿酒酵母菌株是必要的 。传统的基于形态、生理生化的检测和分类鉴定方法常常比较耗 时且结论也不确定和完全，特别是难于从表现型上区分 Saccharomyces 属的 S.cerevisiae， S.bayanus 和 S.diastaticus，因为这些酿酒酵母它们属于同一个属。 Yamagishi等应用标定 FLO1 的开放阅读框架的 PCR 法来区分酿 酒酵母和非酿酒酵母， PCR 分子水平的显示结果表明了二者的不 同 展望 PCR 技术和以 PCR 技术为基础的分子生物学技术 给现代生物学的研究带来了革命性的变化，微生物学 自然也不例外，它们给微生物学的研究开辟了一个新 的天地，微生物由于个体微小和本身研