柴欢宁神颗粒对肝郁失眠证候大鼠模型行为学及下丘脑―垂体―肾上腺轴的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 柴欢宁神颗粒对肝郁失眠证候大鼠 模型行为学及下丘脑垂体肾上 腺轴的影响 摘要 目的 探柴欢宁神颗粒 对多因素复合法致肝郁失眠证候模型大 鼠的行为学和下丘脑-垂体-肾上腺 （HPA）轴的影响。 方法 将 70 只 SD 大鼠雌雄各半，随机分为空白组，模型 组，柴欢宁神颗粒高、中、低剂量组 （2.25、1.125、0.5625 g/kg） ，解郁安神 组（1.25 g/kg） ，艾司唑仑组（0.5 mg/kg） 。除空白组外，其余各组均采用 束缚+夹尾刺激+PCPA 多因素制备肝郁 失眠证候的大鼠模型。各给药组经灌胃 给予相应的药物，空白组及模型组给予 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 等体积的生理盐水，每日 1 次，连续 14 d。分别于实验第 0、7、14、21 天测试 各组大鼠的体重、糖水消耗量、睡眠状 况及水迷宫定位航行和空间搜索能力等 指标评价大鼠的行为学。后采用酶联免 疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠下丘 脑中促肾上腺皮质激素释放激素 （CRH） 、血浆促肾上腺皮质激素 （ACTH）和血清皮质醇（CORT）水 平。 结果 与空白组比较，模型组大鼠 体重、糖水消耗量、睡眠时间、空间搜 索能力明显降低，下丘脑 CRH、血浆 ACTH、血清 CORT 及水迷宫定位航行 时间升高，差异有统计学意义（P 中国 论文网 /6/view-12954574.htm 关键词 柴欢宁神颗粒；肝郁失 眠；下丘脑-垂体- 肾上腺轴；作用机制 中图分类号 R256.23 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2018） 02（b）-0013-05 Abstract Objective To investigate the effects of Chaihuan Ningshen Granules -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 on the behavior and hypothalamic- pituitary-adrenal （HPA） axis of rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi induced by multifactor combination therapy. Methods Seventy SD rats （half male and half female） were randomly divided into 7 groups： blank group， model group， high， medium and low dose of Chaihuan Ningshen Granules groups （2.25， 1.125， 0.5625 g/kg） ， Jieyu Anshen Granules group （1.25 g/kg） ， Estazolam group （0.5 mg/kg）. Except for the blank group， rats in each group were established for the model with syndrome of stagnation of liver qi by multifactorial stimulation including tie， pinch-tail and PCPA. Each administration group was treated daily with an oral infusion of corresponding drug， whereas， the blank group and the model group were given equal volume of saline -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 once a day for 14 days. All rats were tested on the 0， 7th， 14th， 21st d for body weight， sugar consumption， sleep status， water maze navigation and spatial search ability to evaluate the behavior of rats， The levels of corticotropin-releasing hormone （CRH） ， adrenocorticotropic hormone （ACTH） and serum cortisol （CORT） in the hypothalamus of rats were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA ）. Results Compared with blank group， the body weight， sugar consumption， sleep duration and spatial search ability of the model group were significantly decreased， while the hypothalamic CRH， plasma ACTH， serum CORT and water maze positioning sailing time were markedly increased （P 0.05）. Compared with the model group， all medicine groups could significantly -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 increase body weight， sleep duration， consumption of sugar water and the number of crossing platform （P 0.05） ， meanwhile decrease the levels of the hypothalamic CRH， plasma ACTH and serum CORT， as well as water maze positioning sailing time， the differences were statistically significant （P 0.05）. Conclusion Chaihuan Ningshen Granules can remarkably improve the behavior of rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi， and prolong their sleep time， the mechanism underlying this event is mainly dependent on the improvement effect of Chaihuan Ningshen Granules on the function of HPA axis. Key words Chaihuan Ningshen Granules； Insomnia with syndrome of stagnation of liver qi； Hypothalamic- pituitary-adrenal axis； Mechanism 失眠是临床上最为常见的一种生 理、心理疾病，指入睡困难或睡眠质量 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 差，给人们的正常工作和生活带来严重 的不良影响1-2。其中，在失眠患者中， 肝郁引起的失眠所占比重较大3。柴欢 宁神颗粒是山西省中医院调节改善肝郁 失眠的常用制剂，组方由柴胡、黄芩、 党参、大黄等 14 味药构成，具有调和 阴阳、宣畅化郁、重镇安神之功，多年 的临床应用对于肝郁失眠有一定的疗效， 但目前对其治疗的具体作用机制尚不明 确。因此本研究采用多因素复合法制备 肝郁失眠的模型，进一步观察柴欢宁神 颗粒对模型大鼠行为学，及对血浆促肾 上腺皮质激素（ACTH） 、血清皮质醇 （CORT）和下丘脑促肾上腺皮质激素 释放激素（CRH ）的影响，从而探讨其 可能的作用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物 SPF 级 6 周龄 SD 大鼠雌雄各半， 体重（20020）g，购自中国食品药品 检定研究院，合格证号 SCXK（京） 2014-0013。大鼠饲养于山西省中医药 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 研究院中药方剂研究所药理动物室，每 笼 56 只，饲养温度 2124，相对 湿度 18%22%，12/12 明暗交替，期 间自由摄食、饮水，以普通饲料喂养。 1.2 药物与试剂 柴欢宁神颗粒（山西千汇药业有 限公司，批号：20170801） ；解郁安神 颗粒（河南辅仁堂制药有限公司，批号： 20161202） ；艾司唑仑（山东信谊制药 有限公司，批号：170407） ；对氯苯丙 氨酸（PCPA） （美国 SIGMA-ALDRICH 公司，批号：SHBG8045V） ；CRH 试剂 盒（上海优仟生物科技有限公司，批号： 2017110） ；ACTH 试剂盒（上海优仟生 物科技有限公司，批号：20171101） ； CORT 试剂盒（上海优仟生物科技有限 公司，批号：20171020） 。 PCPA 的溶解：将 PCPA 充分研 磨，加入生理盐水，后滴加几滴吐温 80 助溶，继续研磨，直至达到基本混溶， 临用时配成 40 mg/mL 混悬液。 1.3 实验仪器 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 KDC-2046 低速冷冻离心机（科 大创新股份有限公司中佳分公司） ； Morris 水迷宫视频跟踪系统（成都泰盟 科技有限公司） ；IXA-T25 数显高速离 心机；Lenovo 电脑；摄像头；OFT-100 开场实验视频分析系统（成都泰盟科技 有限公司） 。 1.4 实验方法 1.4.1 分组与给药 实验当日，依 据 OFT-100 开场实验对大鼠行为学测试 的结果，选取活动次数相近的 SD 大鼠， 依照体重随机分为空白组，模型组，柴 欢宁神颗粒高、中、低剂量组，解郁安 神组，艾司唑仑组，每组 10 只。空白 组与模型组每天灌胃给予等体积量的生 理盐水。柴欢宁神颗粒高、中、低剂量 组（2.25、1.125、0.5625 g/kg） ，解郁安 神组（1.25 g/kg） ，艾司唑仑组（0.5 mg/kg） ，以上各组均按大鼠 1 mL/100 g 配置成相同的水溶液，灌胃给药。于刺 激第 7 天后，造模的同时开始灌胃给药， 每日 1 次，连续 14 d4。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 1.4.2 模型制备 参照文献 5-6的 方法，并加以改进，进行肝郁失眠模型 的建立。适应性喂养结束后，分组每笼 56 只饲养，空白组大鼠无任何外加刺 激，其他组分别用医用胶带将其前肢束 缚，使其活动受限，并坚持每天用尖端 包裹海绵的止血钳夹大鼠尾部（离近端 1/3 处） ，每只 5 min，令其处于打斗状 态，以不破皮流血为度，连续 21 d，并 在造模第 14 天后，注射 40 mg/mL 的 PCPA，连续 2 d。根据肝郁失眠证候文 献建立本研究造模成功的标准7：实 验动物体重下降，饮食活动量明显减少。 体毛凌乱无华，精神萎靡，以圈缩为 主。睡眠节律紊乱，时长下降。再 次刺激时，反抗明显下降，低落。 1.5 观察指标 1.5.1 大鼠一般状态及总睡眠量 从实验开始，分别记录实验第 0、7、14、21 天各组大鼠一般状态的特 征，包括精神状态、活动、毛发、饮食 及排泄等指标，并通过监控摄像系统记 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 录观察各组大鼠的睡眠时间。 1.5.2 糖水实验 实验第 0、6、13、20 天分别禁水不禁食 24 h， 次日给予 1%的蔗糖水，分别测试大鼠 5 h 糖水消耗量。 1.5.3 Morris 水迷宫实验 实验中 水深约 30 cm，水温控制在 24左右， 将各组大鼠面壁从固定的位置放入水中 （第二象限标记处） ，仪器追踪录像系 统自动追踪记录大鼠潜伏期（大鼠完全 爬上平台并停留 2 s） ，如果大鼠在 2 min 内未找到平台，将其引至平台8。 从造模第 14 天开始训练，1 次/d，连续 5 d，选取最后 2 d 的成绩平均值为最终 的定位航行成绩。第 6 天撤去水中的平 台，记录大鼠 2 min 中内穿越原平台的 次数，分别作为评价大鼠成绩的指标9。 1.5.4 大鼠下丘脑 CRH、血浆 ACTH、血清 CORT 含量检测 各行为 学实验考察结束后，10%水合氯醛腹腔 注射麻醉，腹主勇鋈 ，一部分放 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 入抗凝管中，一部分置于 EP 管中，后 迅速断头，置于冰袋上取出下丘脑等脑 组织，放置液氮罐中，最后存放于- 80冰箱中备用；将血清、血浆静置 30 min 后，4，3000 r/min 离心（离心半 径为 16 cm） ，取上清液，于-20存放， 照试剂盒说明，分别进行下丘脑 CRH、血浆 ACTH、血清 CORT 的检测。 1.6 统计学方法 采用 SPSS 19.0 统计学软件对原 始数据进行统计分析，计量资料数据以 均数标准差（xs ）表示，多组间比较 采用 One-way ANOVA 单因素方差分析， 两两组间比较，方差齐则采用 LSD 法， 方差不齐采用 Dunnett-t 检验。以 P 0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 各组间大鼠宏观体表特征及 睡眠量 实验前各组大鼠毛色光亮、活动 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 灵敏，精神状态良好，睡眠正常；实验 刺激第 7 天时，除空白组外，其余各组 大鼠毛色明显灰暗，行动迟缓，大多弓 背贴壁行走，叫声变尖细，组内打斗明 显，胡须下垂，大多表现为聚积奢睡， 且大便开始不成形；14 d 时，模型组大 鼠毛发明显凌乱，夹尾刺激反抗低落， 大便溏薄稀，大多弓缩在角落，体重与 空白组比较明显下降（P 0.05） ，与给 药组比较差异也有统计学意义（P 0.05） （图 1） ；21 d 时，模型组大鼠精 神明显萎靡，全部弓缩在角落，体重与 给药组比较差异均有统计学意义（P 0.05） （图 1） ，且通过摄像记录系统观 察到模型组大鼠睡眠节律紊乱，总睡眠 量明显减少，与空白组比较差异有高度 统计学意义（P 0.01） ，而给药组状态 明显好转，毛色有光泽，睡眠时间较模 型组明显延长，与模型组比较差异有统 计学意义（P 0.05 或 P 0.01） （图 2） 。 实验过程中模型组大鼠死亡 1 只（可能 注射 PCPA 导致） 。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 2.2 对肝郁失眠模型大鼠糖水偏 爱度的影响 在大鼠接受 7、14、21 d 刺激后， 与空白组比较，模型组大鼠糖水的偏爱 度明显下降（P 0.05 或 P 0.01） ；实 验第 21 天时，与模型组比较，各给药 组大鼠 撬的偏爱度均明显增加（P 0.05） ，尤以艾司唑仑组明显（P 0.01） 。见表 1。 2.3 对肝郁失眠模型大鼠水迷宫 定位航行及空间搜索的影响 与空白组比较，模型组大鼠定位 航行时间明显延长（P 0.01） ，穿台次 数显著减少（P 0.05） ；与模型组比较， 各给药组均较明显缩短了其定位航行的 时间，且增加了穿越平台的次数，差异 有统计学意义（P 0.05） 。见表 2。 2.4 对肝郁失眠模型大鼠下丘脑 CRH、血浆 ACTH、血清 CORT 的影响 与空白组比较，模型组下丘脑 CRH、血浆 ACTH、血清 CORT 的含量 均明显升高（P 0.05 或 P 0.01） 。与 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 模型组比较，各给药组均对上述指标有 明显改善（P 0.05 或 P 0.01） 。见表 3。 3 讨论 随着社会、生活等各方面压力的 增加，肝郁化火、肝郁气滞已成为引起 失眠的主要病机，大多表现为心烦怒燥、 胸闷胀痛、舌红、苔黄等10。柴欢宁 神颗粒以柴胡、黄芩、大黄为君药，配 伍党参等 14 味药组方，能调阴阳、散 肝郁、安心神，故为治疗肝郁化火兼有 痰热的良方，并被临床广泛应用所证明。 本研究采用大鼠束缚+夹尾刺激+PCPA 的多因素复合法制备大鼠肝郁失眠证候 的动物模型，并从实验药效学的角度对 其进行了科学论证。 目前研究已表明11-12：长期慢 性的束缚与夹尾刺激可使大鼠出现诸如 胡须下垂、弓背贴壁行走、饮食减少、 叫声尖细等情绪低落的表征。这种表现 基本符合情感不舒，郁怒藏抑于体内， 肝气郁滞，而导致的“ 肝郁 ”证候。而中 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 医理论中“肝主藏血 ”，肝郁久而化热， 耗费阴血而致血不养心，进而神魂不宁、 虚烦不眠。 因此本研究在“肝郁” 的基 础上，进一步腹腔注射 PCPA，耗竭大 鼠体内 5-HT，大鼠出现明显昼夜节律 紊乱、躁动不安、昼夜不寐的现象，从 而科学模拟肝郁失眠的大鼠模型13。 目前已有众多的文献表明，采用此种方 法可以较好地建立肝郁失眠的大鼠模型 14-15。在对大鼠施加 3 周的刺激进行 造模后，分析大鼠的体重、糖水消耗、 水迷宫学习记忆能力等行为活动为测试 指标。本研究结果显示，与空白组对比， 模型组各项指标均显著降低（P 0.05） ， 说明动物模型的建立可信、可靠。临床 肝郁失眠患者情绪低落，昼夜不寐，次 日精神萎靡，渐之身体消瘦，影响正常 工作生活。这与模型动物体重、糖水的 喜好度、记忆力下降、睡眠节律紊乱、 总睡眠量减少等特征表现相类似。因此 对于柴欢宁神颗粒治疗肝