x连锁遗传性视网膜劈裂症的研究进展

连锁遗传性视网膜劈裂症的分子遗传学与治疗研究进展 冶卓 纪艳丽 综述 马翔 审校 Recent progress in molecular genetics and therapy for in X- linked Congenital Retinoschisis Ye Zhuo，Ma Xiang， Department of Ophthamology，First Affiliate Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011 一概述 X 连锁遗传性视网膜劈裂症（ X-linked Congenital Retinoschisis，XLRS）是引起男性青 少年黄斑变性的主要原因。早在 1898 年，德国眼科医生 Hass 描述了 2 例男性典型的放射 状黄斑囊样变性，后证实为 X 连锁遗传性视网膜劈裂症。 XLRS 临床表现具有高度的变异 性，但主要以内层视网膜裂开而致黄斑区微囊样车轮状改变为特征，约 50%的病例有周边 部视网膜大疱状的损害 1-4。大多数患者在学龄期出现进行性视力损害，至疾病后期可因并 发玻璃体出血、脉络膜硬化、视网膜脱离、以及视网膜萎缩等而使视力明显下降甚至致盲 5,6。视网膜电图（ERG）检查见起源于内层视网膜的 b 波降低而代表光感受器的 a 波相对 保持正常或轻微下降，导致 b/a 比值降低是本病的特征性电生理改变 7。另外，干涉光断层 扫描（OCT）见神经纤维层裂隙、及眼底照相、荧光血管造影（FFA）等亦有助于本病的 诊断。本病全世界均有发病，患病率为 1:50001：25000 8，以 X 连锁隐性方式遗传，男 性发病，女性可作为携带者而无临床表现。 二分子遗传学研究 XLRS1 基因是第一个被分离出来的引起黄斑营养不良的基因。RS1 基因定位于 Xp22.122.2 区段，Sauer 首先确定了 XLRS1 基因的结构 9，XLRS1 由大约 15000 个碱基 对组成，包含 6 个外显子（AF018958AF018962）,编码包含一段高度疏水的信号肽的由 224 个氨基酸组成的蛋白质，信号肽在肽酶的作用下断裂后生成成熟的蛋白，称为视网膜 劈裂蛋白（Retinoschisin 或 RS1）,Retinoschisin 包含一高度保守的环形区域，由 XLRS1 的 46 个外显子编码,认为其表达与细胞与细胞之间黏着及磷脂间的结合有关 1012。 XLRS1 的基因突变记录于由视网膜劈裂协会建立并由 Leiden 大学维护的数据库中，有 超过 150 种 RS1 等位基因突变被鉴别出来（X-Linked Retinoschisis Sequence Variation database at http:/www.dmd.n1/rs） ，包括碱基替代（86.9） 、碱基插入（1.1） 、碱基缺失 （10.4） 、碱基重复(2.1%)以及碱基插入 /缺失突变（0.3 ）等。碱基替代中又包括错义突 变和无义突变，其中约 87的突变发生于编码环状区域的 46 外显子，与大量的致病突 变不同，只有五种良性 DNA 多态性，这同样也反映了环状区域的高度保守性。目前尚未 明确表型与基因型之间的对应关系，有相同基因突变的亲属成员之间的表型也有着很大差 异，这些都提示存在其他基因调控或环境影响。Britt A. Johnson 发现在 7 号染色体上 Mar1 基因可能调控 XLRS 的症状，Mar1 对偶基因纯合子的 RS1 基因敲除小鼠症状明显减轻 13。 人类 RS1 蛋白有 6 个外显子编码的 224 氨基酸构成，RS1 蛋白过去认为只在视网膜表达， Takda 通过对基因敲除小鼠的研究，发现 RS1 蛋白除视网膜外在松果体中亦有表达，视网 膜与松果体都起源于神经外胚层，在松果体中的 RS1 蛋白并不表达于神经间质细胞，RS1 基因敲除小鼠的松果体在组织学上未见异常，RS1 蛋白在松果体中的功能尚需进一步研究 14。在视网膜中 RS1 蛋白由光感受器细胞与双极细胞合成后分泌，后被 Mller 细胞摄取并 将其传递至内层视网膜发挥作用。RS1 由二硫键连接成的同源八倍体，Wu 等 15 通过光谱 测定及免疫沉淀法研究显示，RS1 蛋白与光感受器细胞与双极细胞层的 Na/K ATP 泵的功 能及负性调节膜蛋白 SARM1 有关。 XLRS1 突变的确切的致病机理尚不清楚。由于 RS1 包含与细胞粘附及细胞间相互作用 有关的高度保守的环形区域，因此推测由于突变 XLRS1 基因所表达的蛋白产物的分泌障碍 和黏附功能的丧失，细胞与细胞间通信受损和视网膜层间黏附作用减弱而在内层视网膜形 成劈裂腔 12,16-19。目前的研究焦点集中于突变对蛋白的结构、表达和分泌过程及其作用方 式的影响方面。XLRS1 基因的错义突变可能干扰蛋白折叠而导致蛋白构象及细胞内分布和 清除异常。为证实这一假设，Wang 等 19 在 COS-7 细胞中表达了七种致病 XLRS1 错义突变， 包括信号肽区域突变、环状区域上游突变、以及五种环状区域的突变，并研究其在细胞内 的分布及转运。结果发现 WTRS1 分泌正常而突变 RS1 分泌和细胞内含量明显减少或缺失。 因此，认为这些错义突变致病机制主要是氨基酸发生突变后干扰蛋白正确折叠导致蛋白空 间构象改变，使蛋白不能被分泌而滞留于细胞内，从而导致疾病的发生。这一设想将不同 的突变归结为共同的致病途径 7。 Wu 等 16 研究了 12 种与 RS 有关的错义突变蛋白的表达、构象特点、细胞内定位和分泌。 将致病突变分为三组：第一组是编码 RS1 疏水引导肽序列的基因突变，阻止信号肽形成 螺旋，导致蛋白插入 ER 膜障碍而滞留于胞浆，被蛋白酶迅速降解；第二组包括编码环 状结构侧翼部分的基因突变，RS1 亚单位无法组装以二硫键连接的有黏附功能的寡聚复合 物；第三组是位于编码环状区域的致病突变，直接导致环状区域空间结构改变，错误折叠 的蛋白滞留于 ER 内而导致疾病发生。 三 动物模型和基因治疗的探索 为了进一步探讨 RS1 蛋白的功能及其在细胞水平的 XLRS 的发病机制，目前为止已建 立了 3 种小鼠动物模型。2002 年 Weber 等 18 将基因 lacz 和新霉素抗性基因(Neo r)克隆插入 XLRS1 第 3 外显子框架中，建立了部分 3 和 4 外显子及整个 3 内含子缺失的 RS1h 基因剔 除鼠模型，即 XLRS1h-/Y 鼠。2004 年 Zeng 等 20 用新霉素抗性基因(Neo r)替代 XLRS1 的第一 外显子及部分第一内含子（1.6kb）而建立无效等位基因鼠模型(XLRS1h)。2005 年 Jablonski 等 22 用 ENU（ N-乙基-N- 亚硝基脲 ）诱变致畸方法，使 RS1 基因第二内含子中剪切位点 T C 点突变，10bp 在外显子 1 后插入，外显子 2 中 26bp 片段缺失，从而建立起动物模型 （44TNJ） 。 本课题由国家自然科学基金（NO：30973263）资助 作者单位：116011 大连；大连医科大学第一附属医院眼科（冶卓，马翔，纪艳丽） 通讯作者：马翔（Email： ） 三种鼠动物模型都具有与人 XLRS 组织形态学及网膜功能有相类似的改变：组织学检 查示鼠视网膜内核层明显裂开，核层空洞及网膜细胞不规则移位导致网膜各层结构紊乱， 内层视网膜囊样改变；后期光感受器细胞发生退化病变，以视锥细胞退化较为严重;ERG 检 测示 b 波下降明显，以至出现典型的“负向 ERG”表现等。因此认为这 3 种鼠动物模型是 可以作为研究视网膜结构紊乱的分子机制的模型，有助于研究 RS1 蛋白在突触联系的建立 及维持中所起的作用，同时也是探求 XLRS 基因治疗手段的适宜实验体系。 由于先天性视网膜劈裂的发生具有明确的基因突变的遗传基础，因此基因治疗或在基 因水平的干预治疗成为实现对先天性视网膜劈裂根本治疗方法和途径。目前针对 2 种基因 敲除小鼠的基因替代治疗都已通过最初的实验阶段，用腺病毒相关病毒载体介导一个正常 RS1 基因插入基因组以代替致病基因，并成功在 2 种基因敲除小鼠网膜各层表达了正常 RS1 蛋白，同时 ERG 检查示在接受玻腔注射 rAAV(2/2)-CMV-RS1 治疗后，丢失的 b 波重 现，证实鼠网膜功能得到了恢复，一次玻璃体腔注射后最长能使网膜功能维持 5 个月之久 21，同时组织学形态学也证实在基因治疗后鼠椎体内外节与杆外结构完整性较好，光感受 器细胞丢失减少。这些都为 XLRS 病理机制研究与基因治疗研究提供了关键信息。但是目 前为止我们对基因治疗的长期疗效、免疫反应及与载体相关的并发症等还不是很清楚,需要 进一步研究证实。 四 临床治疗 目前先天性网膜劈裂的临床治疗仍以临床观察及并发症治疗为主，尚无有效治疗。在少 年期和青年期诊断的 XLRS 患者视力相差很大，绝大部分患者视力集中于 20/8020/25 之 间，由于此病发展相对缓慢，绝大多数患者 50 多岁出现黄斑变化时才有视力减退，可暂不 必治疗，只进行临床观察。若出现斜视、屈光不正、弱视等并发症时应最大程度的进行矫 正；对伴有周边网膜劈裂的劈裂腔周围行冷凝，激光光凝甚至电凝等治疗或保守观察；对 合并有视网膜脱离玻璃体出血的病例，行巩膜扣带术及玻璃体切割术。但各种治疗方法均 无满意效果，且有可能因为盲目手术更加重本病。 2010 年美国伊利诺伊州立大学的 Genead 等 23 给予 15 名 29 眼先天性网膜劈裂患者 2% 多佐胺（2% dorzolamide）滴眼液，以每日 3 次点眼治疗， 11 人 20 眼 1 个月内 OCT 检查 黄斑感觉神经层光学透明带显著减少，12 名患者 16 眼视力有显著提高。巴西的 Moura Bastos24 对一名 12 岁发病 4 年的 XLRS 男性患者进行了相同的治疗， 1 个月内黄斑感觉神 经层光学透明带显著减少并且左眼视敏度由 20/100 提高到 20/80+2，右眼视敏度由 20/80 提 高至 20/50。但这种治疗的具体机制目前尚不清楚， Saloni Walia 25 认为可能与多佐胺代偿 增强视网膜色素上皮细胞的液体转运功能有关，但具体机制仍需进一步研究。 五 结语 综上所述，XLRS由XLRS1 基因突变引起，XLRS1 基因编码包含高度保守的环状区域的 蛋白RS1 。当XLRS1发生突变时，RS1分泌和黏附功能障而导致视网膜内层发生劈裂。相信 随着我们对于XLRS的分子遗传机制了解的不断加深，以及分子生物学技术中的新方法、新 载体的不断发展，XLRS的基因治疗必将成为现实，为更多的患者带来希望。 参考文献 1. Xiaoxin Li，Xiang Ma, et al. Clinical features of X linked juvenile retinoschisis in Chinese families associated with novel mutations in the RS1 gene，Mol Vis. 2007; 13: 804812. 2. Tantri A, Vrabec TR, Cu-Unjieng A, et al. X-Linked Retinoschisis:A Clinical and Molecular Genetic Review.Surv Ophthalmol,2004,49:214 3. George ND, Yates JR, Moore AT.X-linked retinoschisis. Brit J Ophthal, 1995,79: 697 4. Kellner U, Brummer S, Foerster MH, et al. X-linked congenital retinoschisis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 1990;228:432. 5. George ND, Yates JR, Moore AT. Clinical features in affected males with X-linked retinoschisis. Arch Ophthalmol,1996;114:274. 6. Forsius H, Krause U, Helve J, et al. Visual acuity in 183 cases of X-chromosomal retinoschisis. Can J Ophthalmol,1973,8:385. 7. Eksandh LC, Ponjavic V, Ayyagari R, et al. Phenotypic expression of juvenile X-linked retinoschisis in Swedish families with different mutations in the XLRS1 gene. Arch Ophthalmol,2000,118:1098. 8. Mooy CM, Van Den Born LI, Baarsma S, et al. Hereditary Xlinked juvenile retinoschisis: a review of the role of Muller cells. Arch Ophthalmol,2002, 120:979. 9Sauer CG, Gehrig A, Warneke-Wittstock R, et al. Positional cloning of the gene associated with X-linked juvenile retinoschisis. Nat Genet,1997,17:164. 10. Molday LL, Hicks D, Sauer CG, et al. Expression of X-linked retinoschisis protein RS1 in photoreceptor and bipolar cells.Invest Ophthalmol Vis Sci,2001, 42:816. 11. Reid SN, khmedov NB, iriev NI, et al. Themouse X-linked juvenile retinoschisis cDNA:expression in photoreceptors.Gene,1999,227:257. 12. Grayson C, Reid SN, Ellis JA, et al. Retinoschisin, the Xlinked retinoschisis protein, is a secreted photoreceptor protein, and is expressed and released by Weri-Rb1 cells. Hum Mol Genet,2000,9:1873. 13. Britt A. Johnson, Natsuyo Aoyama Nicole H. Friedell,et al. Genetic Modication of the Schisis Phenotype in a Mouse Model of X-Linked Retinoschisis. Genetics, 2008,178:1785. 14. Takada, Y, Robert N. Fariss,M. et al. Retinoschisin expression and localization in rodent and uman pineal and consequences of mouse RS1 gene knockout.2006 Mol. Vis. 12: 1108 15. Laurie L. Molday, Winco W. H. Wu. Retinoschisin (RS1), the Protein Encoded by the X- linked Retinoschisis Gene, Is Anchored to the Surface of Retinal Photoreceptor and Bipolar Cells through Its Interactions with a Na/K ATPase-SARM1 Complex THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2007, 282: 32792 16. Wu WW, Molday RS. Defective discoidin domain structure,subunit assembly, and endoplasmic reticulum processing of retinoschisin are primary mechanismsresponsible for X- 本课题由国家自然科学基金（NO：30973263）资助 作者单位：116011 大连；大连医科大学第一附属医院眼科（冶卓，马翔，纪艳丽） 通讯作者：马翔（Email： ） linked retinoschisis. J Biol Chem, 2003, 278:28139 17. Molday LL, Hicks D, Sauer CG, et al. Expression of X-linked retinoschisis protein RS1 in photoreceptor and bipolar cells.Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001, 42:816 18. Weber BH, Schrewe H, Molday LL, et al. Inactivation of the murine X-linked juvenile retinoschisis gene, RS1h, suggests a role of retinoschisin in retinal cell layer organization and synaptic structure. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:6222 19. Wang T, Walters CT, Rothman AM, et al. Intracellular retention of mutant retinoschisin is the pathological mechanism underlying X-linked retinoschisis. Hum Mol Genet, 2002, 1 1:3097 20. Zeng Y, Takada Y, Kjellstrom S, et al.RS-1 Gene Delivery to an Adult RS1h Knockout Mouse Model Restores ERG b-Wave with Reversal of the Electronegative Waveform of X- Linked Retinoschisis. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004, 45:3279 21. Sten Kjellstrom, Ronald A. Bush, Yong Zeng,et al. Retinoschisin Gene Therapy and Natural History in the RS1h-KO Mouse: Long-term Rescue from Retinal Degeneration. Investigative Ophthalmology 128(2):190-197 24. Andr Lus Carvalho de Moura Bastos，Bruno de Paula Freitas et al.Use of topical dorzolamide for patients with X-linked juvenile retinoschisis: case report Arq Bras Oftalmol. 2008;71:286 25. Saloni Walia, Gerald A. Fishman, et al. Relation of Response to reatment with Dorzolamide inX-Linked Retinoschisis to the Mechanism of Functional Loss in Retinoschisin. Am J Ophthalmol 2009;147:111115. 连锁遗传性视网膜劈裂症分子遗传学与治疗的研究进展 冶卓 纪艳丽 综述 马翔 审校 摘要 X 连锁遗传性视网膜劈裂症（ X-linked Congenital Retinoschisis XLRS,OMIM#312700）是一种少见的 X 连锁隐形遗传病，主要累及双侧视网膜,造成 神经纤维层和神经节细胞层之间的劈裂，患者具有典型的车轮状中心凹劈裂和视网膜 电图 b/a 比值下降的特征性电生理改变，是由于 XLRS1 基因发生突变而导致的一种遗 传性眼底疾病，本文就 XLRS 这一疾病的发病机制、动物实验和临床治疗的最新研究 进展作一综述，引用了参考文献 25 篇。 关键词 X 连锁遗传性视网膜劈裂症，治疗学，模型，动物 Recent progress in molecular genetics and therapy for in X- lin