人肺腺癌细胞a549的耐药性与放射敏感性的相关性研究

摘要】 目的 研究肺腺癌细胞株 A549 及耐药株 A549/DDP 放射敏感性差异，探讨肺 腺癌的耐药性与放射敏感性的关系。方法 对指数生长期的 A549、A549/DDP 细胞用 6 mV 直线加速器分成 0、1、2、4、6、8、10、12 Gy 8 个剂量点进行放射。倒置显微镜观察细 胞的形态变化，并根据细胞克隆计数，计算 SF2，绘制细胞存活曲线。结果 放疗后两种细 胞株的细胞形态发生改变,部分细胞死亡、破碎。A549 和 A549/DDP 细胞株的 SF2 分别为 0.417 和 0.685。结论 肺腺癌肿瘤细胞产生耐药性后可以使其放射敏感性降低。 【关键词】 A549 细胞；耐药性；放射敏感性 化疗和放疗结合的综合治疗是中晚期肺癌最常见的治疗模式，并多采用有铂类药物的 诱导化疗方式，但是文献报道证明多次化疗后可以产生耐药性1，2 。因此，放化疗如何 结合，化疗后的耐药性对放射敏感性有何影响，成为人们关注的问题。本文对人肺腺癌细 胞株 A549 与耐顺铂细胞株（ A549/DDP）放射敏感性的变化进行研究，探讨耐药性对放射 敏感性的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株 人肺腺癌细胞株 A549 由黑龙江省肿瘤研究所提供，A549/DDP 自湖南省万佰生物有限 公司购买。 1.1.2 试剂及药品 优级胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DMEM 培养液购自( 北京索莱宝 公司)；胰酶由黑龙江省肿瘤研究所自行配制；二甲基四氮唑蓝（MTT）和二甲基甲砜 （DMSO）为 Sigma 产品； 顺铂为科鼎医疗有限公司产品。 1.1.3 仪器 倒置显微镜为 Olympus（日本产） ；苏州市金燕净化设备厂生产的 YJ 1450B 型医用 净化工作台；北京医用离心机厂的低速离心机；电热手提式压力蒸汽消毒器为哈尔滨市松 花江医疗器械厂生产；血球计数板为丹阳光学仪器厂生产；CO2 恒温培养箱为美国 REVCO RCO 3000T，数码照像机为日本 SONY T10。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 将 A549 细胞、A549/DDP 细胞用高糖 DMEM 培养液培养（含 10%的优级胎牛血清、 青霉素 100 U/ml、链霉素 100 g/ml） ，放置 37、5%CO2 孵箱中培养。每日观察细胞生 长情况,待细胞铺满整个培养瓶底面 80%后，进行细胞传代。 1.2.2 观察细胞形态 分别取对数生长期的 A549 及 A549/DDP 细胞，生理盐水清洗换液后，在倒置显微镜 下观察活细胞的形态结构，并拍照。放疗后细胞培养 15 d，在倒置显微镜下观察活细胞的 形态结构，并拍照。比较放疗前后的细胞形态变化。 1.2.3 细胞存活曲线 取指数生长期的 A549 及 A549/DDP 细胞接种于 25 ml 培养瓶中（两组细胞的具体细胞 接种数见表 1)，每种细胞分 0、1、2、4、6、8、10、12 Gy 共 8 个剂量点照射，照射源为 VIRIAN 2300C/D 型双光子直线加速器，能量 6 mV，剂量率 4 Gy/min，源皮距 100 cm，细 胞表面加 1 cm 厚的组织补偿物，每个剂量照射 3 瓶，常规照射后培养 15 d 后计数克隆形 成。用 1%结晶紫染色 1 min,生理盐水冲洗完全后晾干，计数 50 个细胞以上的克隆数，计 算每个剂量点克隆数的平均值，从而计算两组细胞每个剂量点的存活分数（SF） ，根椐单 击多靶模型，绘制细胞存活曲线，求出各组的 D0(指在存活曲线直线部分把 SF 从 0.1 降至 0.037 或从 0.01 降至 0.003 7 所需的剂量，是在每个细胞引起一次致死事件所需的平均剂量)、 Dq(即准域剂量，是指将存活曲线的直线部分反向延长，通过 SF 1.0 与剂量轴相交处的剂 量，用来代表存活曲线的肩宽)、SF2( 指肿瘤细胞在 2 Gy 电离射线照射后的 SF)，比较各组 的放射敏感性。表 1 A549、 A549/DDP 细胞株的接种细胞数（略） 细胞存活分数（SF）=受照射细胞的贴瓶率（PE）/ 对照细胞的贴瓶率(PE)100%。 细胞贴瓶率（PE）= 克隆数/ 细胞接种数100% 。 1.3 统计学方法 应用 SPSS13.0 软件对实验数据进行统计学分析。 2 结 果 2.1 细胞形态学变化 见图 1。A549 细胞接受放射前呈椭圆形，胞体两侧可见伪足状突起；镜下胞膜呈白色 环状，界限清晰，胞质透亮，细胞核无聚集。A549/DDP 细胞接受放射前呈椭圆形，但较 A549 细胞细长，两侧伪足状突起更细长，胞体可见较多细小突起。镜下胞膜呈白色环状， 界限清晰，胞质透亮，细胞核无聚集，部分可见核仁。 A549 及 A549/DDP 细胞接受放射后细胞形态发生变化，放射后两种细胞表现相似：镜 下见两侧伪足状突起变短、变淡，细胞膜变淡，与周围界限模糊，胞质内可见粗颗粒状物， 细胞核聚集成大小不等的颗粒；部分细胞核碎裂，胞膜破碎；部分细胞坏死破碎成无结构 的细胞碎片悬浮于培养液中，可见多核巨细胞。 2.2 SF 及 SF2 测定 每个剂量点耐药细胞株 A549/DDP 的 SF 均比同一剂量亲代细胞 A549 的 SF 高( 见表 2)， 尤其是代表放射敏感性的 SF2 值(A549/DDP 为 0.685，也同样高于 A549 的 0.417)，说明 A549 的放射敏感性高于耐药细胞株 A549/DDP。表 2 A549、A549/DDP 细胞株不同放射 剂量的 SF（略） 2.3 细胞存活曲线 耐药细胞株 A549/DDP 的 D0（3.008 3） 、Dq （1.571 4）均高于 A549 的 D0（2.336 0） 、 Dq（0.824 0） ，说明肩区增宽，放射敏感性降低，见图 2。 3 讨 论 临床实验表明，放化疗联合应用可增加肿瘤完全消退率和局部控制率，并可降低远处 转移率3 ，但是放化疗如何结合，才能获得最大的临床获益，仍是人们关注和研究的重 点问题。目前绝大多数学者认为同步放化疗效果最佳，但其副反应大，病人不容易耐受； 诱导化疗病人耐受性较好，因此普遍采用这种结合方式，但是临床观察显示治疗效果有时 达不到预期目标，认为可能是由于肿瘤细胞的加速再增殖以及耐药细胞同时产生对放射线 的交叉耐受4 。 但是目前研究对肿瘤细胞的耐药性与耐放射性之间的关系仍不明确，Kato 等5分 别检测了体外培养的 HNSCC 及 UMSCC 等头颈部鳞状细胞癌耐顺铂细胞株的放射敏感性， 认为其化疗耐药性与耐放射性无明显关系。但是 Wolf 等6报道临床观察到对顺铂耐药 的头颈部肿瘤往往放疗效果也不好，提示耐药性与放射抗性之间有一定联系。孙海等7 研究结果显示，化疗诱导耐药前后鼻咽癌 CNE1（高分化鳞癌） 、CNE2（低分化鳞癌）细 胞的 SF2 由化疗诱导前的 0.641、0.187 增高为耐药后的 0.686、0.355，表明其放射敏感性 在诱导化疗后降低，并且不同鼻咽癌细胞株在化疗诱导耐药后放疗敏感性的改变并不相同， 亲代放射敏感性较高的细胞株（SF2 低）诱导化疗后其放射敏感性更易受耐药性的影响。 SF2 值是评价恶性肿瘤放射敏感性的指标之一，临床放疗敏感性低的恶性肿瘤 SF2 值高， 临床放疗敏感性高的恶性肿瘤 SF2 值低。而本实验中 A549 细胞株的 SF2 比耐药细胞株 A549/DDP 低，结果显示耐药细胞的放射敏感性与亲代相比明显下降，表明诱导化疗后耐 药性的产生对放射敏感性有很大影响。 临床上很多肿瘤病人在综合治疗方案中均涉及放化疗结合的综合治疗，研究化疗诱导 肿瘤多药耐药后肿瘤放射敏感性的改变对临床上化疗后需要进一步放疗的病人治疗具有一 定的指导意义。 【参考文献】 1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126 例J;中国中医药科技;1999 年 06 期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002 年 05 期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003 例痤疮患者特征分析与控制对策J; 中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002 年 06 期 5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗 J;临床医药实践杂志;2003 年 09 期 6 高宜云;痤疮从肝论治J;中医药临床杂志;2004 年 03 期 7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮 J;中华皮肤科杂志;2004 年 09 期 8 陈五一;痤疮辨治体会J;世界中医药;/yisheng/main/index.php.2007 年 03 期 9 雷放;中药热敷治疗痤疮有效 J;新中医;/book/main/index.php.1992 年 09 期 10 李东华;异维生素 A 酸治疗痤疮J;新医学 /;1993 年 10 期 11 黄灿奇;针刺联合中药内服外敷治疗青少年痤疮临床观察D;南方医科大学;2011 年 12 陈志彬;中医综合疗法对女性痤疮患者皮肤生理指标影响研究D; 广州中医药大学;2011 年 13 陈传伟;针刺干预慢性疲劳综合征的临床及作用机理研究D;广州中医药大学;2010 年 14 Hamid Abdi;针刺对伊朗肥胖者的体重及抗热休克蛋白 27、60、65、70 的影响D; 北京 中医药大学;/book/main/index.php.2010 年 15 陈玉骐;背俞穴刺络放血治疗痤疮的临床研究 D;广州中医药大学;2009 年 16 张随学;电针镇痛的脑功能磁共振初步研究 D;复旦大学;2005 年 17 庞莹;痤疮的流行病学及与雄激素受体基因多态性的相关研究D;中国医科大学;2008 年 18 申鹏飞;“醒脑开窍”针刺方法治疗卒中后抑郁症基础与临床疗效及治疗机制研究D; 天 津中医学院;/qikan/c