GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G  G 012食品安全国家标准食品微生物学检验 志贺氏菌检验中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布2012本 标准 代替 食品 卫生 微生 物学 检验 志 贺氏 菌检 验 。本 标 准 与 / ， 主 要 变 化 如 下 ：修 改 了 标 准 名 称 ； 修 改了 培养 基和 试剂 ；修 改了 操 作步 骤中 增 菌部 分 和 生 化试 验及 附加 生化 试验 部分 ；修 改了 表 2；修 改了 表 4。贺氏菌检验1范 围本 标准 规定 了食 品中 志贺 氏 菌 ( 检验 方法 。本 标准 适用 于食 品中 志贺 氏 菌 的检 验。2设 备和 材料 除 微生 物实 验室 常规 灭菌 及培 养设 备外 ，其 他设 备和 材料 如下 ：a） 恒 温培 养箱 ： 36 1 ；b） 冰 箱： 2 5 ；c） 膜 过滤 系统 ；d） 厌 氧培 养装 置： 1 ；e） 电 子 天 平： 感量 f） 显 微镜 ： 10 10 ；g） 均 质器 ；h） 振 荡器 ；i） 无 菌吸 管： 1具  ） 、 10具 ） 或微 量移 液器 及吸 头 ；j） 无 菌 均 质杯 或 无菌 均 质袋 ： 容量 50mL；k） 无 菌培 养皿 ：直 径 90m；l）  管 或精 密  ；m） 全 自动 微生 物生 化鉴 定系 统。3培 养基 和试 氏 菌增 菌肉 汤 霉 素 ： 见 附录 凯 （ 琼脂 ： 见 附录 赖 氨酸 脱氧 胆酸 盐（ 琼脂 ： 见 附录 氏 菌显 色培 养基 。铁 （ 琼脂 ： 见 附录 琼 脂斜 面： 见 附录 体 琼脂 ： 见 附录 糖 铵培 养基 ： 见 附录 琼 脂： 见 附录  糖苷 酶培 养基 ： 见 附录 酸 脱羧 酶试 验培 养基 ： 见 附录 酵 管： 见 附录 氏 柠檬 酸盐 培养 基 ： 见 附录 酸 盐培 养基 ： 见 附录 胨 水、 靛基 质试 剂： 见 附录 氏 菌属 诊断 血清 。鉴 定试 剂盒 。4检 验程 序 志 贺氏 菌检 验程 序见 图 1。志 贺氏 菌检 验程 序5操 作步 以 无菌 操作 取 检 样 25g（ m L） ， 加 入装 有灭 菌 25m 氏 菌增 菌肉 汤 的 均 质杯 ， 用 旋转 刀片 式均质 器以 80r/m 100r/m  ； 或 加 入装 有 25m 志 贺氏 菌增 菌肉 汤 的 均 质袋 中 ， 用 拍 击式 均质器 连 续均 质 1m 2m 液体 样品 振荡 混匀 即可 。 于 ， 厌 氧 培养 16h 20h。 取 增菌 后的 志贺 氏增 菌液 分别 划线 接种 于 平 板 和 平 板或 志 贺氏 菌显 色培 养基 平板上 ， 于 36 1 培 养 20h 24h， 观 察各 个平 板上 生长 的菌 落形 态。 宋 内氏 志贺 氏菌 的单 个菌 落直 径 大于 其他 志 贺 氏 菌 。 若 出现 的菌 落不 典型 或菌 落较 小不 易观 察 ， 则 继续 培养 至 48 行 观察 。 志 贺氏 菌在不 同选 择性 琼脂 平板 上的 菌落 特征 见表 1。36 ， 20h 48可 疑菌 落 半 固体 ，营 养琼 脂斜 面 贺 氏菌 显色 培养 基生 化鉴 定报 告血 清学 分型志 贺氏 菌属 分群 及分 型结 果检 样25g（ 或 25m L） 样品 +志 贺氏 菌增 菌肉 汤 25m ，16h 志 贺氏 菌在 不同 选择 性琼 脂平 板上 的菌 落特 征选择性琼脂平板 志贺氏菌的菌落特征色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐志贺氏菌显色培养基  生 化试 择 性琼 脂平 板上 分别 挑 取 2个 以上 典型 或可 疑菌 落 ， 分 别接 种 半 固体 和 营养 琼脂 斜面 各一管 ，置 36 1 培 养 20h 24h， 分 别观 察结 果 。 三糖 铁琼 脂中 斜面 产碱 、 底 层产 酸 （ 发 酵葡 萄糖 ， 不 发酵 乳糖 ， 蔗 糖 ） 、 不 产气 （ 福 氏志 贺氏菌 6型 可产 生少 量气 体） 、不 产硫 化氢 、半 固体 管中 无动 力的 菌株 ， 挑 取 其  培养 的 营 养 琼 脂斜 面上 生长 的菌 苔 ， 进行 生化 试验 和血 清学 分型 。试 验及 附加 生化  试 验用  培养 的 营 养 琼 脂斜 面上 生长 的菌 苔 ， 进 行生 化试 验 ， 即 糖 苷酶 、 尿 素 、 赖 氨酸 脱羧酶 、 鸟 氨酸 脱羧 酶以 及水 杨苷 和七 叶苷 的分 解试 验。 除宋 内氏 志贺 氏菌 、鲍 氏志 贺氏 菌 13型 的鸟 氨酸 阳性 ;宋 内氏 菌 和 痢疾 志贺 氏菌 1型 ，鲍 氏志 贺氏 菌 13型 的 糖 苷酶 为阳 性以 外 ， 其余 生化 试验 志贺 氏菌 属的 培养 物均 为阴 性结 果 。 另 外 由 于福 氏志 贺氏 菌 6型 的 生 化特 性和 痢疾 志贺 氏菌 或鲍 氏志 贺氏 菌相 似 ，必 要时 还需 加做 靛基 质 、 甘 露醇 、 棉 子糖 、 甘 油试 验 ， 也 可做 革兰 氏染 色检 查和 氧化 酶试 验 ， 应 为氧 化 酶阴 性的 革兰 氏阴 性杆 菌 。 生 化反 应不 符合 的菌 株 ， 即 使能 与某 种志 贺氏 菌分 型血 清发 生凝 集 ， 仍 不得 判定为 志贺 氏菌 属 。 志贺 氏菌 属生 化特 性见 表 2。表 2志 贺 氏 菌 属四 个群 的生 化特 征生化反应 疾志贺氏菌 氏志贺氏菌 氏志贺氏菌 内氏志贺氏菌 a a 尿素 赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶 b 水杨苷 七叶苷 靛基质 / ( ) / 甘露醇 c 棉子糖 甘油 ( ) ( ) +表示 阳性； 性； -/+表示 多数阴性； +/数阳性 ； （ +） 表示 迟缓阳性； 不同生化型 。型和鲍氏 13型为阳性 。3型为鸟氨酸阳性 。型和 6型常见甘露醇阴性变种 。生 化实 验由 于某 些不 活泼 的大 肠埃 希氏 菌（ 、  ）菌 的部 分生 化特 征与 志贺 氏菌 相似 ， 并 能与 某种 志贺 氏菌 分型 血清 发生 凝集 ； 因 此前 面生 化实 验符 合志 贺氏 菌属 生化 特性 的培 养物 还需 另 加葡 萄糖 胺 、 西蒙 氏柠 檬酸 盐、 粘液 酸盐 试验 (36 培 养 24h 48h)。 志贺 氏菌 属和 不活 泼大 肠埃 希氏 菌、 生 化特 性区 别 见 表 3。志 贺 氏 菌 属和 不活 泼 大 肠埃 希氏 菌、 生 化特 性区 别生化反应 疾志贺氏菌 氏志贺氏菌 氏志贺氏菌 群：宋内氏 志贺氏菌 大肠埃希氏菌   西蒙氏柠檬酸盐 d   d ： +表示 阳性； 性； 不同生化型 。注 2： 在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、 性 至少有一项反应为阳性。择 生 化鉴 定试 剂盒 或全 自动 微生 物生 化鉴 定系 统 ， 可 根据 步 判断 结果 ， 用 培养 的营 养琼 脂斜 面 上 生长 的菌 苔 ， 使用 生 化鉴 定试 剂盒 或全 自动 微生 物生 化鉴 定系 统 进 行鉴 定。学 的 准备志 贺氏 菌属 没有 动力 ， 所 以没 有 鞭 毛抗 原 。 志 贺氏 菌属 主要 有菌 体 （ O） 抗 原 。 菌 体 又 可分 为型 和群 的特 异性 抗原 。一 般采 用   脂 培 养物 作为 玻片 凝集 试验 用的 抗原 。注 1： 一些志贺氏菌如果因 为 挑取菌苔于 1m 10 煮沸 15m 60m 抗原后再检查。注 2：  与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应 。 与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有 。反 应在 玻片 上划 出 2个 约 12 区域 ， 挑 取一 环待 测菌 ， 各 放 1/2环 于玻 片上 的每 一区 域上 部 ， 在 其中 一个 区域 下部 加 1滴 抗血 清 ， 在 另一 区域 下部 加入 1滴 生理 盐水 ， 作 为对 照 。 再 用无 菌的 接种 环或 针分别 将两 个区 域内 的菌 落研 成乳 状液 。将 玻片 倾斜 摇动 混合 1m 并对 着黑 色背 景进 行观 察， 如 果抗 血清中 出现 凝结 成块 的颗 粒 ， 而 且生 理盐 水中 没有 发生 自凝 现象 ， 那 么凝 集反 应为 阳性 。 如 果生 理盐 水中 出现凝 集， 视作 为自 凝。 这时 ，应 挑取 同一 培养 基上 的其 他菌 落继 续进 行试 验。 如 果 待 测菌 的 生 化特 征符 合志 贺氏 菌属 生化 特征 ，而 其血 清学 试验 为阴 性的 话， 则按 5.进 行试 验。 学 分型 （选 做项 目）先 用四 种志 贺氏 菌多 价血 清检 查 ， 如 果呈 现凝 集 ， 则 再用 相应 各群 多价 血清 分别 试验 。 先 用 氏志 贺氏 菌多 价血 清进 行实 验， 如呈 现凝 集， 再用 其群 和型 因子 血清 分别 检查 。 如 果 价 血清 不凝 集 ，则 用 内 氏志 贺氏 菌血 清进 行实 验 ， 如 呈现 凝集 ， 则 用其 相 和 相 血 清检 查 ； 如 果 B、 价 血清 都不 凝集 ， 则 用 疾 志贺 氏菌 多价 血清 及 1 12各 型因 子血 清检 查 ， 如 果上 述三 种多 价血 清都 不凝集 ， 可 用 氏 志贺 氏菌 多价 检查 ， 并 进一 步用 1 18各 型因 子血 清检 查 。 福 氏志 贺氏 菌各 型和 亚型 的型 抗 原 和 群抗 原鉴 别见 表 4。表 4福 氏志 贺氏 菌各 型和 亚型 的型 抗原 和群 抗原 的鉴 别表型和亚型 型抗原 群抗原 在群因子血清中的凝集3,4 6 7,81a 4 + -  （ 4） ， 6 (+) +  3,4 + -  7,8 - - +（ 续） 福 氏志 贺氏 菌各 型和 亚型 的型 抗原 和群 抗原 的鉴 别表型和亚型 型抗原 群抗原 在群因子血清中的凝集3,4 6 7,83a （ 3， 4） ,6,7,8 (+) + +3b （ 3,4） ,6 (+) +  3,4 + -  6 - +  7,8 - - +5a （ 3,4） (+) -  7,8 - - +6 4 + -  7,8 - - +Y - 3,4 + - +表示 凝集； 凝集 ； （） 表示 有或无 。报 告综 合以 上生 化试 验和 血清 学鉴 定的 结果 ，报 告 25g（ m L） 样品 中检 出或 未检 出 志 贺氏 菌。 基 和试 氏 菌增 菌肉 汤 霉 素 （ 氏 菌增 菌肉  胰 蛋白 胨 糖 氢 二钾 二 氢钾 钠  80（ 蒸 馏水 将 以上 成 分 混合 加热 溶解 ， 冷 却 至 25 左 右校 正 2， 分 装适 当的 容器 ， 12 灭 菌 15m  出后 冷却 至 50 5 ， 加入 除菌 过滤 的新 生霉 素溶 液（ m L） ， 分装 25m 。注： 如不立即使用，在 2 8条件下可储存一个月。霉 素溶  新 生霉 素 水 将 新生 霉素 溶解 于蒸 馏水 中 ， 用  滤膜 除菌 ， 如 不立 即使 用 ， 在 2 8条 件下 可储 存一个 月。 时 每 25m 氏 菌增 菌肉 汤（  加入 5m 霉 素溶 液（ ， 混匀 。凯 （  蛋 白胨  盐 钠 红 紫  水 将 以 上 成分 混合 加热 溶解 ，冷 却至 25 左 右校 正 分装 ， 12 高 压灭 菌 15m 冷却 至 45 50 ， 倾注 平板 。注： 如不立即使用，在 2 8条件下可储存二周。赖 氨酸 脱氧 胆盐 （ 膏 酸    胆 酸钠 钠 硫 酸钠 酸 铁铵   水 除 酚红 和琼 脂外 ，将 其他 成分 加入 40m 水 中， 煮沸 溶解 ， 校 正 另将 琼脂 加入 60m 水 中， 煮沸 溶解 。将 上述 两溶 液混 合均 匀后 ，再 加入 指示 剂， 待冷 至 50 5 倾 注平 皿。注 ： 本培养基不需要高压灭菌 ， 在制备过程中不宜过分加热 ， 避免降低其选择性 ， 贮于室温暗处 。 本培养基宜于当天制备 ， 第二天使用 。 使用前必须去除平板表面上的水珠 ， 在 37 5 温度下 ， 琼脂面向下 、 平板盖亦向下烘干 。 另外如配制好的培养基不立即使用，在 2 8条件下可储存二周。铁 （  蛋 白胨 浸 膏   糖 亚 铁铵 (6钠 硫 酸钠   水 除 酚红 和琼 脂外 ， 将 其他 成分 加于 40m  水 中 ,搅 拌均 匀 ,静 置约 10m  热使 完全 溶化 ,冷 却至 25 左 右校 正 另将 琼脂 加于 60m  水 中， 静置 约 10m 加热 使完 全溶 化 。 将两 溶液 混合 均匀 ， 加 入 5%酚 红水 溶液 5m L， 混 匀 ， 分 装小 号试 管 ， 每 管约 3m L。 于 12 灭 菌 15m  成高 层斜 面。 冷却 后呈 桔红 色。 如 不立 即使 用， 在 2 8 条 件下 可储 存一 个月 。琼 脂斜  蛋 白胨 膏 钠  水 将 除琼 脂以 外的 各成 分溶 解于 蒸馏 水内 ， 加 入 15%氢 氧化 钠溶 液约 2m L， 冷 却至 25 左 右校 正 2。 加入 琼脂 ，加 热煮 沸， 使琼 脂溶 化。 分 装小 号试 管， 每管 约 3m 。 于 12 灭 菌 15m  成斜 面。注： 如不立即使用，在 2 8条件下可储存二周。体  蛋 白胨 膏 钠  水 按 以上 成分 配好 ，加 热溶 解， 并 校正 分装 小试 管， 12 灭 菌 15m 直立 凝固 备用 。 糖 铵培  氯 化钠 镁 （ 7二 氢铵 氢 二钾 糖   麝香 草酚 蓝水 溶液 蒸 馏水 先 将盐 类和 糖溶 解于 水内 ，校 正 再加 琼脂 加热 溶解 ，然 后加 入指 示剂 。混 合均 匀后分 装试 管， 12 高 压灭 菌 15m 制成 斜面 备用 。方 法用 接种 针轻 轻触 及培 养物 的表 面， 在盐 水管 内做 成极 稀的 悬液 ，肉 眼观 察不 到混 浊， 以每 一接 种环内 含菌 数在 2010之 间为 宜。 将接 种环 灭菌 后挑 取菌 液接 种， 同时 再以 同法 接种 普通 斜面 一支 作为 对照 。 于 36 1 培 养 24h。 阳 性者 葡萄 糖铵 斜面 上有 正常 大小 的菌 落生 长 ； 阴 性者 不生 长 ， 但 在对 照培 养基 上生 长良 好。 如在 葡萄 糖铵 斜面 生长 极微 小的 菌落 可视 为阴 性结 果。 注 ： 容器使用前应用清洁液浸泡 。 再用清水 、 蒸馏水冲洗干净 ， 并用新棉花做成棉塞 ， 干热灭菌后使用 。 如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。 琼  蛋 白胨 钠 糖 二 氢钾  红溶 液   素溶 液 蒸 馏水 除 酚红 和尿 素外 的其 他成 分加 热溶 解 ， 冷 却至 25 左 右校 正 加 入酚 红指 示剂 ， 混 匀 ，于 12 灭 菌 15m 冷至 约 5 ， 加入 用  滤膜 除菌 后 的 20%尿 素水 溶液 10m L， 混匀 ，以无 菌操 作分 装灭 菌试 管， 每管 约 3m L4m L， 制成 斜面 后放 冰箱 备用 。方 法挑 取琼 脂培 养物 接种 ， 在 36 1 培 养 24h， 观 察结 果 。 尿 素酶 阳性 者由 于产 碱而 使培 养基 变为红 色。半 乳糖 苷酶 培养 法 （  邻 硝基 苯 糖 苷 (60.m 磷 酸钠 缓冲 液 (1%蛋 白胨 水 (将 缓 冲液 内 ， 加 入蛋 白胨 水 ， 以 过滤 法除 菌 ， 分 装于 10m m 75m m 试 管内 ， 每 管 ，用 橡皮 塞塞 紧。 方 法自 琼脂 斜面 挑取 培养 物一 满环 接种 ， 于 36 1 培 养 1h34结 果。 如果 糖 苷酶 产生 ，则 于 1h3色 ，如 无此 酶则 24色 。法 （  蛋 白胨 钠 4氯  糖 苷 (20.m  水 将 各成 分 （ 加 热煮 沸于 1 ， 冷 却 至 25 左 右校 正 15 高 压灭 菌 10m  注平 板避 光冷 藏备 用。 方 法挑 取琼 脂斜 面培 养物 接种 于平 板 ， 划 线和 点种 均可 ， 于 36 1 培 养 18h24结 果 。 如 果 糖 苷酶 产生 ， 则 平板 上培 养物 颜色 变蓝 色 ， 如 无此 酶则 培 养物 为 无 色或 不透 明色 ， 培 养 48h72分 转为 淡粉 红色 。 酸 脱羧 酶试 验培  蛋 白胨 浸 膏 糖  甲酚 紫 溶 液  氨 酸和 鸟氨 酸 0m 水 除 氨基 酸以 外的 成分 加热 溶解 后， 分装 每瓶 10m L， 分别 加入 赖氨 酸和 鸟氨 酸。 酸 按  入 ， 酸 按 1%加 入 ， 再 校正 对 照培 养基 不加 氨基 酸 。 分 装于 灭菌 的小 试管 内 ，每 管  上面 滴加 一层 石蜡 油， 15 高 压灭 菌 10m 试 验方 法从 琼脂 斜面 上挑 取培 养物 接种 ， 于 36 1 培 养 18h 24h， 观 察结 果 。 氨 基酸 脱羧 酶阳 性者 由于 产碱 ，培 养基 应呈 紫色 。阴 性者 无碱 性产 物， 但 因葡 萄糖 产酸 而使 培养 基变 为黄 色 。 阴性 对 照管 应为黄 色 ， 空白 对照 管为 紫色 。酵  牛 肉膏 胨 钠 氢 二钠 （ 12 麝香 草酚 蓝溶 液 蒸 馏水 糖 发酵 管按 上述 成分 配好 后 ， 按  入葡 萄糖 ， 25 左 右校 正 分 装于 有一 个倒 置小 管的 小试 管内 ， 12 高 压灭 菌 15m 其 他各 种糖 发酵 管可 按上 述成 分配 好后 ,分 装每 瓶 10m L， 12 高 压灭 菌 15m 另 将各 种糖类 分别 配好 10%溶 液， 同时 高压 灭菌 。将 5m 液 加入 于 10m 培 养基 内， 以无 菌操 作分 装小 试管 。注： 蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。方 法从 琼脂 斜面 上挑 取小 量培 养物 接种 ， 于 36 1 培 养 ， 一 般观 察 2d3d。 迟 缓反 应需 观察 14d30d。氏 柠檬 酸盐 培养  氯 化钠 镁 （ 7二 氢铵 氢 二钾 酸 钠   麝香 草酚 蓝溶 液 蒸 馏水 先 将盐 类溶 解于 水内 ，调 至 加入 琼脂 ，加 热溶 化。 然后 加