GB 4789.34-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 012食品安全国家标准食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布2012012本 标准 代替 食品 卫生 微生 物学 检验 双 歧杆 菌检 验 。本 标准 与 /， 主要 变化 如下 ： 修 改了 标准 的中 文名 称； 修 改了 培养 基和 试剂 ； 删 除了 果糖 盐 磷酸 酮酶 （ 测定 和双 歧杆 菌的 计数 方法 。0121食品安全国家标准食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定1范 围本 标准 规定 了食 品中 双歧 杆菌 （ 的鉴 定方 法。本 标准 适用 于食 品中 双歧 杆菌 的鉴 定。2设 备和 材料 除 微生 物实 验室 常规 灭菌 及培 养设 备外 ，其 他设 备和 材料 如下 ：a） 恒 温培 养 箱 ： 36 1 ；b） 气 相色 谱仪 配  器 ；c） 冰 箱 ： 2 5 ；d） 天 平： 感 量 e） 无 菌 试 管： 18m m 180m m 、 15m m 10m m ；f） 无 菌吸 管 ： 1m L（ 具 刻 度 ） 、 10m L（ 具 刻 度 ） 或 微量 移液 器 （ 20L 10L）及 配套 吸头 ；g） 无 菌锥 形 瓶： 50m L、 250m L。3培 养基 和试 杆 菌 培 养 基 ：见 附录   培 养 基 ：见 附录   ： 分 析纯 。甲 烷： 分析 纯。： 分析 纯 （ 体 积比 ） 。酸 ：分 析纯 （ 体 积比 ） 。： 分析 纯。标 准溶 液 ： 吸 取分 析纯 冰乙 酸 ， 移 入 10m 瓶 中 ， 加 水至 刻度 ， 标 定 ， 标 定方 法见 附录 B， 此 溶液 浓度 约为 1m 。 标 准使 用液 ： 将 经标 定的 乙酸 标准 溶液 用水 稀释 至 。 标 准 溶 液 ： 吸 取 分 析 纯 乳 酸 ， 移 入 10m  瓶 中 ， 加 水 至 刻 度 ， 标 定 ， 标 定 方 法 见 附录 B， 此溶 液浓 度约 为 1m 。标 准使 用 液 ： 将 经标 定的 乳酸 标准 溶液 用水 稀释 至 。01224鉴 定程 序 双 歧杆 菌鉴 定程 序见 图 1。图 1双 歧杆 菌鉴 定程 序5操 作步 制 的 全部 制备 过程 均应 遵循 无菌 操作 程序 。菌 操作 称 取 25g（ m L） 样 品 ， 置 于装 有 25m 盐 水的 灭菌 锥形 瓶内 ， 制 成 1:0的 样 品匀液 。 及 涂布 培养 步骤厌 氧， 481样 品 25g（ m L） +25m 生 理盐 水10倍 系列 稀释革 兰氏 染色 ，过 氧化 氢酶 试验报 告选 择 2个 3个 适当 稀释 度， 各取 分 别加 入到 双 歧杆 菌琼 脂平 板进 行涂 布挑 取菌 落接 种于 双 歧杆 菌 琼 脂平 板接 种 培 养基 生 化反 应测 定乙 酸 、 乳 酸 厌 氧， 481厌 氧， 481m 吸 管或 微量 移液 器吸 取 1:0样 品匀 液 ， 沿管 壁缓 慢注 于装 有 9m 盐 水的无 菌试 管中 （注 意吸 管尖 端不 要触 及稀 释液 ）， 振摇 试管 或换 用 1支 无菌 吸管 反复 吹打 使其 混合 均匀 ， 制成 1:0的 样品 匀液 。 1m 吸 管或 微量 移液 器吸 头， 按 顺 序， 做 10倍 递增 样品 匀液 ，每 递增 稀释 一次 ，即 换用 1次 1m 吸 管或 吸头 。待 鉴定 菌种 的活 菌数 ，选 择三 个连 续的 适宜 稀释 度， 每个 稀释 度吸 取 稀 释液 ，用 歧 杆菌 琼脂 平板 进行 表面 涂布 ,每 个稀 释度 作两 个平 皿。 置 36 1 温 箱内 培养 48h2h， 培养 后选 取单 个菌 落进 行纯 培养 。 养 挑 取 3个 或以 上的 菌落 接 种于 双 歧杆 菌 琼 脂 平 板， 厌 氧， 36 1 培 养 48h。及 生化 镜 检双 歧杆 菌菌 体 为 革兰 氏染 色阳 性 ， 不 抗酸 、 无 芽孢 ， 无 动力 ， 菌 体形 态多 样 ， 呈 短杆 状 、 纤 细杆 状或球 形， 可形 成各 种分 支或 分叉 形态 。 鉴 定过 氧化 氢酶 试验 为阴 性 。 选 取 纯 培养 平 板上 的 三 个单 个 菌 落 ， 分 别 进 行生 化反 应检 测 ， 不 同 双 歧杆 菌菌 种主 要生 化反 应 见 附 录 B。酸 代谢 产物 测定 气 相色 谱法 测定 双歧 杆菌 的有 机酸 代谢 产物 ,见 附录 C。6报 告 根 据镜 检及 生化 鉴 定的 结 果 （ 、 双 歧杆 菌的 有机 酸代 谢产 物乙 酸与 乳酸 微摩 尔之 比大 于 1（ 5.） ，报 告 双 歧杆 菌属 的种 名 。0124附 录 杆 菌琼 脂培  蛋 白胨 浸 膏 糖 性 淀粉 钠 柿 浸出 液 吐 温 80  粉 馏 水至 氨 酸盐 溶液称 取半 胱氨 酸 加入 盐 酸， 使 半 胱氨 酸全 部溶 解， 配制 成半 胱氨 酸盐 溶液 。柿 浸出 液将 新鲜 的西 红柿 洗净 后称 重切 碎 ， 加 等量 的蒸 馏水 在 10 水 浴中 加热 ， 搅 拌 90m 然 后用 纱布过 滤， 校正 将 浸 出液 分装 后， 12 高 压灭 菌 15m 20m 培 养基将 成 分加 入蒸 馏水 中 ， 加 热溶 解 ,然 后加 入 半 胱氨 酸盐 溶液 ， 校 正 分 装后 12 高 压灭 菌 15m 20m 临用 时加 热熔 化琼 脂， 冷至 50 时 使用 。培  蛋 白胨 糖 粉 氨 酸 液 维 生素  血 红素 溶液 5m g/m L 加 蒸馏 水至 液称 取无 水氯 化钙 硫酸 镁 磷酸 氢二 钾 磷酸 二氢 钾 碳酸 氢钠 氯化钠 加蒸 馏水 至 10m L。血 红素 溶液 （ 5mg/ 取氯 化血 红素  1m  氧化 钠 中 ，加 蒸馏 水至 10m L， 12 高 压灭 菌 15m 20m 素 称 取维 生素 加无 水乙 醇 9m L， 过滤 除菌 ，冷 藏保 存。基除 氯化 血红 素溶 液和 维生 素 外 ， 成 分加 入蒸 馏水 中， 加热 溶解 ，校 正 加入 中性 红溶 液。 分装 后 12 高 压灭 菌 15m 20m 临用 时加 热熔 化琼 脂， 加入 氯化 血红 素溶 液和维 生素 ， 冷至 50 使 用。0126附 录 杆 菌菌 种主 要生 化反 应双 歧杆 菌菌 种主 要生 化反 应见 表  杆 菌菌 种主 要生 化反 应编号 项目 两歧双歧杆菌 (儿双歧杆菌 (长双歧杆菌 (春双歧杆菌 (物双歧杆菌 (短双歧杆菌 (甘油 2赤癣醇 3 4 + + + 5 + + + +6 + + d + +7 8阿东醇 9  甙 10d + + + d +1 + + + + +12d  +  +  d  d  +13 + + 14 15 16卫矛醇 17肌醇 +18甘露醇 19山梨醇 20  糖 甙 21  糖 甙 + 2葡萄糖胺 +23苦杏仁甙（扁桃甙 ） + + 24熊果甙 25七叶灵 + + + 26水杨甙（柳醇） + + + 27 + d 28 + + + + +29 + + + + +30 + + + + +31 + + + + +32糖 ） 3菊糖（菊根粉） 34 + + 35 + + + + +0127表 续） 双 歧杆 菌菌 种主 要生 化反 应编 号 项目 两歧双歧杆菌 (儿双歧杆菌 (长双歧杆菌 (春双歧杆菌 (物双歧杆菌 (短双歧杆菌 (6淀粉 + 37肝糖（糖原） 38木糖醇 39龙胆二糖 + + + +40 41 42 43 4 45 46 47葡萄糖酸钠 + 482  糖 酸 钠 495  糖 酸 钠 注： +表示 90以上菌株阳性； 0以上菌株阴性； 89以上菌株阳性。0128附 录 色 谱法 测定 双歧 杆菌 的有 机酸 代谢 杆 菌培 养液 制备挑 取 双 歧杆 菌 琼 脂平 板上 纯培 养的 双歧 杆菌 接种 于 培 养基 ， 同 时用 未接 种菌 的 培养 基做 空白 对照 ，厌 氧， 36 1 培 养 48h。液 的配 标 准溶 液准 确吸 取乙 酸 加 水稀 释至 ， 摇 匀 ， 进 行标 定 ， 配 成约 的 乙酸 标准 溶液 。标 定方 法为 ： 准 确称 取乙 酸 3g， 加水 15m L， 酚酞 指示 液 2滴 ，用 1m ol/m 化 钠溶 液滴 定， 并将滴 定结 果用 空白 试验 校正 。 1m ol/m 化 钠溶 液相 当于 酸 。使 用液将 经标 定的 乙酸 标准 溶液 用水 稀释 至 20.m m 。标 准溶 液准 确吸 取含 量为 85% 90%的 乳酸 ， 加水 稀释 至 ， 摇匀 ，配 成 的 乳酸 标准溶 液。 标定 方法 为： 准确 称取 乳酸 1g， 加水 50m L， 加入 1m ol/m 化 钠滴 定液 25m ， 煮沸 5m  入酚 酞指 示液 2滴 ， 同 时用 ol/m 滴 定液 滴定 ， 并 将滴 定结 果用 空白 试验 校正 。 1m ol/m 化 钠溶 液相 当于 酸 。使 用液将 乳酸 标准 溶液 用水 稀释 至 20.m m 。的 处理取 双 歧杆 菌 培 养液 放 入 10m 管 中， 加入 50 （ 体 积比 ） 硫酸 溶液 ，混 匀， 加入 丙 酮， 混匀 后加 过量 氯化 钠， 剧烈 振摇 1m 再加 入 乙 醚， 振摇 1m 于 30r/m  5m 将上 清液 转入 另一 试管 中， 下层 溶液 用 丙 酮和 乙 醚重 复提 取 2次 ，合 并有 机相 ，于 40 水 浴中 用氮 气吹 至少 量溶 液存 在， 用丙 酮定 容至 ， 混匀 后备 用。 同样操 作步 骤处 理乙 酸标 准和 空白 培养 液。 的 处理取 双 歧杆 菌 培 养液 放 入 10m 管 中 ， 10 水 浴 10m 加 入 50%（ 体积 比 ） 硫酸 溶液 ，混 匀， 加入  醇， 于 58 水 浴 30m 水 ， 加三 氯甲 烷 ， 振摇 3m 30r/m  5m 取三 氯甲 烷层 分析 。同 样操 作步 骤处 理乳 酸标 准和 空白 培养 液。色 谱条 件色 谱柱 ： 长 2m ， 内 径 4m m 的 玻璃 柱 ， 填 装涂 有 20 吐 温 60（ 的 80 10目 ） ； 柱 温 ： 10 ； 汽 化室 ： 150 ； 检 测器 ： 150 ； 载 气 ： （ 50m l/m 进 样量 外标 法峰 面积 定量 。乳 酸标 准 溶 液的 气相 色谱 见图 乙 酸标 准 溶 液的 气相 色谱 见图 0129图 标 准溶 液的 气相 色谱 图 标 准溶 液的 气相 计 算样 品培 养液 中乙 酸或 乳酸 的含 量 按 式（ 计算 ： =标 空样X （  中： X样 品培 养液