分子生物学技术总结

分子生物学技术总结 姓名：梁潇 班级：2 班 学号：1080800066 一、核酸/蛋白分离技术 1 DNA 分离：破碎细胞 抽提蛋白质 DNA 沉淀乙醇洗除盐琼脂糖凝胶电泳检测 用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入 SDS 破裂核膜，用蛋白酶 K 使核蛋白降解成 小片段并从 DNA 是上解离下来，经苯酚、氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀 DNA，75% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，真空干燥后，溶解于 TE 缓冲液中即得到相对分子量高的 DNA。 2 RNA 分离：抑制 RNase抽提去蛋白质DNase 消化 DNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 3蛋白分离： 离子交换层析 （1 ）层析法 亲和层析 （2 ）电泳分离：聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝 胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的 形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而 SDS-PAGE 仅根据蛋白质亚基分子量的不 同就可以分开蛋白质。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而 与所带电荷和分子形状无关。 应用：分离蛋白质和寡糖核苷酸 二、基因克隆技术 1 PCR：在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促 和反应，PCR 技术的特异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 ）变 性（9295） 2）退火 3）延伸 PCR 各步骤的目的 通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行 交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带 电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离 纯化的方法。离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用， 利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分 离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电， 所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯 化及精制的各个步骤中。 利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从 而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键 形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的 样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物 质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。改 变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所 用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。具有 专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA 与互补 DNA 或 RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋 白、糖蛋白与植物凝集素等。 （1）预变性：破坏 DNA 中可能存在的较难破坏的二级结构。 使 DNA 充分变性，减少 DNA 复杂结构对扩增 的影响，以利于引物更好的和模板结合，特 别是对于基因组来源的 DNA 模板，最好不要吝啬这个步骤。此 外，在一些使用热 启动 Taq 酶的反应中，还可激活 Taq 酶，从而使 PCR 反应得以顺利进行。 （2）变性-退火-延伸循环：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双 链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合， 为下轮反应做准备； 模 板 DNA 与引物的退火(复性) ：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链 的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为 反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制 链。 （3）PCR 仪扩增循环后 72 度延伸 10 分钟：用 PCR 仪扩增时,(变性.退火 ,延伸) 循环完成后,继续 72 度延伸了 10 分钟的原因：延伸时间取决于待扩增 DNA 片段的长度。 （当然是在反 应体系一定的条件下）根据延伸 速率推得，扩增 1kb 以内的 DNA 片段 1min 即可，而 3-4kb 则需要 3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适 当的将延伸时间延长至 4-10min，这样做是使 PCR 反应完全以提高扩增产量 继续 72 度延伸了 10 分钟 除了可以使 PCR 反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通 Taq 酶进行 PCR 扩增时在产物末 端加 A 尾的作用，可以直接用于 TA 克隆的进行。 基因组 PCR（无内含子基因） PCR RT-PCR（含有内含子的基因） RACE/Gene Walking（从部分基因获得全长基因） SMARTTM 3-RACE：利用 mRNA 的 3 末端的 poly(A)尾巴作为一个引物 结合位点，以连有 SMART 寡核 苷酸序列通用接头引物的 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物反转录合成标准第一链 cDNA。然后用一个基因特 异引物 GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以 cDNA 第一链为模板， 进行 PCR 循环，把目的基因 3 末端 的 DNA 片段扩增出来。 SMARTTM 5-RACE：先利用 mRNA 的 3末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物在反转录酶 MMLV 作用下，反转录合成标准第一链 cDNA。利用 该反转录酶具有的末端转移 酶活性，在反转录 达到第一链的 5 末端时自动加上 3-5 个(dC) 残基 ，退火后 (dC)残基与含有 SMART 寡核 苷酸序列 Oligo(dG)通用接头引物配对后， 转换为以 SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图） 。然后用一个含有部分接头序列的 通用引物 UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异 引物 2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以 SMART 第一链 cDNA 为模板，进行 PCR 循环， 把目的基因 5末端的 cDNA 片段扩 增出来。最 终，从 2 个有相互重叠序列的 3/ 5-RACE 产物中获得全长 cDNA，或者通过分析 RACE 产物的 3和 5端序列，合成相应引物扩增出全长 cDNA。 2 文库筛选 （1 ）基因组文库：某种生物全部基因组 DNA 序列的随机片段重组 DNA 克隆的群体。该文 逆转录 PCR 由一条 RNA 单链转录为互补 DNA(cDNA)称作“逆转录” ， 由依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（逆转录酶）来完成。随后， DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖 RNA 的 DNA 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的 PCR。原先的 RNA 模板被 RNA 酶 H 降解，留下互补 DNA。 通过 RT-PCR 技术由已知部分 cDNA 序列来得到完整的 cDNA 5 和 3 端 库以 DNA 片段的形式贮存着某种生物全部基因组的信息，可以用来选取任何一段感兴趣的 序列进行复制和研究。材料来自生物体基因组是 RNA(如 RNA 病毒) 所构建的核酸片段克隆 群体，也是该生物的基因组文库。 基因上下游： 基因上游：存在 P-box 和 TATA-box 一个是识别启动子的位点，一个是激活启动子的位点 基因下游： 核酸分子杂交筛选：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则 形成双链的过程。杂交双方分别称为探针与待测核酸。杂交分子：杂交后形成的异源双链 分子。 核酸分子杂交技术：是指用标记的已知 DNA 或 RNA 片段检测样品中未知核酸序列， 通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位 置或大小显示出来。核酸探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的互补 DNA 或 RNA 片段。通常用核素或非核素示踪标记。 原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等） 碱基互补配对结合，重新形成双链；在这过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化， 以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。 应用：定性或定量检测 DNA 或 RNA 序列片段的有力工具。 （1）cDNA 文库：以 mRNA 为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成 cDNA，与适当 的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段 cDNA，并能 繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRNA 信息的 cDNA 克隆集合称为该组织细胞的 cDNA 文库。纯正基因 分子杂交/免疫筛选 三、基因功能分析技术 （一）基因结构： 1转录起始点： （1）TATA 框（TATA box）：其一致顺序为 TATAATAAT。它约在基因转录起始点上游约-30- 50bp 处，基本上由 A-T 碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为 RNA 聚合酶的结合处之 一，RNA 聚合酶与 TATA 框牢固结合之后才能开始转录。 （2）CAAT 框（CAAT box）：其一致顺序为 GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区， 位于转录起始点上游约-80-100bp 处，可能也是 RNA 聚合酶的一个结合处，控制着转录起 始的频率。 2引物延伸：变性退火延伸 3启动子：启动子是一段位于结构基因 5端上游区的 DNA 序列，能活化 RNA 聚合酶， 使之与模板 DNA 准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子的结构影响了它与 RNA 聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平 4瞬时表达：瞬时转染后的初期，质粒或 DNA 片段是游离在细胞中的，能够进行表达， 成为瞬时转染表达。随后，游离在细胞中的质粒或 DNA 片段有两种归化，一种是被降解， 还有一种是插入染色体中而能够持续地稳定地表达。 人类结构基因 4 个区域：编码区，包括外显子与内含子；前导区，位于编码区上游，相当于 RNA5末端 非编码区（非翻译区）；尾部区，位于 RNA3编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；调控区，包 括启动子和增强子等。基因 编码区的两 侧也称为侧翼顺序 外 显 子 和 内 含 子 大 多 数 真 核 生 物 的 基 因 为 不 连 续 基 因 （interruptesd 或 discontinuous gene）。所 谓 不 连 续 基 因 就 是 基 因 的 编 码 顺 序 在 DNA 分 子 上 是 不 连 续 的 ，被 非 编 码 顺 序 所 隔 开 。编 码 的 顺 序 称 为 外 显 子 （exon），是 一 个 基 因 表 达 为 多 肽 链 的 部 分 ；非 编 码 顺 序 所 称 为 内 含 子 （intron）,又 称 插 入 顺 序 （intervening sequence,IVS）。内 含 子 只 转 录 ，在 前 mRNA(pre-mNRA)时 被 剪 切 掉 。如 果 一 个 基 因 有 几 个 内 含 子 ，一 般 总 是 把 基 因 的 外 显 子 分 隔 成 n+1 部 分 。内 含 子 的 核 苷 酸 数 量 可 比 外 显 子 多 许 多 倍 。 外 显 子 外 显 子 内 含 子 接 头 每 个 外 显 子 和 内 含 子 接 头 区 都 有 一 段 高 度 保 守 的 一 致 顺 序 （consensus seqence）,即 内 含 了 5末 端 大 多 数 是 GT 开 始 ，3末 端 大 多 是 AG 结 束 ，称 为 GT-AG 法 则 ，是 普 遍 存 在 于 真 核 基 因 中 RNA 剪 接 的 识 别 信 号 。 侧 翼 顺 序 侧 翼 顺 序 在 第 一 个 外 显 子 和 最 末 一 个 外 显 子 的 外 侧 是 一 段 不 被 翻 译 的 非 编 码 区 ，称 为 侧 翼 顺 序 （flanking sequence）。侧 翼 顺 序 含 有 基 因 调 控 顺 序 ，对 该 基 因 的 活 性 有 重 要 影 响 。 转 录 过 程 启 动 子 启 动 子 （promoter）包 括 下 列 几 种 不 同 顺 序 ，能 促 进 转 录 过 程 ： （1）TATA 框 （TATA box） （2）CAAT 框 （CAAT box） （3）GC 框 （GC box）：有 两 个 拷 贝 ，位 于 CAAT 框 的 两 侧 ，由 GGCGGG 组 成 ，是 一 个 转 录 调 节 区 ，有 激 活 转 录 的 功 能 。 此 外 ，RNA 聚 合 酶 负 责 转 录 tRNA 的 DNA 和 5SrDNA，其 启 动 子 位 于 转 录 的 DNA 顺 序 中 ， 称 为 下 游 启 动 子 。 5增 强 子 在 真 核 基 因 转 录 起 始 点 的 上 游 或 下 游 ，一 般 都 有 增 强 子 （enhancer）,它 不 能 启 动 一 个 基 因 的 转 录 ，但 有 增 强 转 录 的 作 用 。此 外 ，增 强 子 顺 序 可 与 特 异 性 细 胞 因 子 结 合 而 促 进 转 录 的 进 行 。 研 究 表 明 ，增 强 子 通 常 有 组 织 特 异 性 ，这 是 因 为 不 同 细 胞 核 有 不 同 的 特 异 因 子 与 增 强 子 结 合 ，从 而 对 基 因 表 达 有 组 织 、器 官 、时 间 不 同 的 调 节 作 用 。 6终 止 子 在 一 个 基 因 的 末 端 往 往 有 一 段 特 定 顺 序 ，它 具 有 转 录 终 止 的 功 能 ，这 段 终 止 信 号 的 顺 序 称 为 终 止 子 （termianator）。终 止 子 的 共 同 顺 序 特 征 是 在 转 录 终 止 点 之 前 有 一 段 回 文 顺 序 ，约 7-20 核 苷 酸 对 。回 文 顺 序 的 两 个 重 复 部 分 分 由 几 个 不 重 复 碱 基 对 的 不 重 复 节 段 隔 开 ，回 文 顺 序 的 对 称 轴 一 般 距 转 录 终 止 点 16-24bp。 在 回 文 顺 序 的 下 游 有 6-8 个 A-T 对 ，因 此 ，这 段 终 止 子 转 录 后 形 成 的 RNA 具 有 发 夹 结 构 ，并 具 有 与 A 互 补 的 一 串 U，因 为 A-U 之 间 氢 健 结 合 较 弱 ，因 而 RNA/DNA 杂 交 部 分 易 于 拆 开 ，这 样 对 转 录 物 从 DNA 模 板 上 释 放 出 来 是 有 利 的 ，也 可 使 RNA 聚 合 酶 从 DNA 上 解 离 下 来 ，实 现 转 录 的 终 止 。 （二）基因拷贝数 拷贝数就是指某目的基因（可以是质粒）在某一生物群体或个体中存在的个数. 单拷贝就 是该基因在基因组中只有一个,多则指有多个。 Southern blot 检验：常用的 DNA 定量的分子生物学方法。 原理：Southern 杂交是利用标记的探针（probe）与膜上靶 DNA 片段进行杂交的技术，检 测靶 DNA 片段中是否存在与探针同源的序列。将待测的 DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤 维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置 上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入 的拷贝数。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针(序列已知)进行特异性的靶序 列检测。 应用：目的基因检测，定性 基因拷贝数，定量 过程：基因重组与转化重组质粒提取与鉴定质粒大量制备探针制备 Southern Blot 细胞培养 基因组 DNA 制备 DNA 浓度测定 酶切 （三）转录模式 1 Northern blot：在变性条件下将待检的 RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同 Southern Blot 相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 2 （半）定量 RTPCR：半定量 RT-PCR 一般是在没有条件做实时 PCR 的情况下使用，用 于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因 （如 -actin）的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另外还要做一个 -actin 的内参照对照。 （四）生物功能分析 1过表达分析： 2基因抑制或敲除分析：某一突变基因的表型效应由于第二个突变基因的出现而恢复正常 时，称后一突变基因为前者的抑制基因。回复突变使突变基因的脱氧核糖核酸（DNA）分 子结构恢复正常；抑制基因则并不改变突变基因的 DNA 分子结构 ，而只是使突变型的表 型恢复正常。抑制基因一般用符号 Su 代表。当抑制作用发生在同一基因中时，这种抑制作 用称为基因内抑制，属于不同基因的抑制作用则称基因间抑制。 （五）蛋白定位 GFP 融合表达亚细胞定位：亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。 例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。GFP 是绿色荧光蛋白，在扫描共聚集显微镜的激 光照射下回发出绿色荧光，从而可以精确地定位蛋白质的位置。GFP，实际是给你要研究 的物质加上标记，在此相当于报告蛋白的作用。使用 GFP 必须构建融合蛋白载体，并在转 染之后有效表达。这样，若在荧光显微镜下看到细胞内某一部位存在 GFP 信号，说明和 GFP 融合的蛋白也存在于该部位，这样就达到了确定某物质亚细胞定位的目的。应用 DNA 亚克隆技术，将目的基因与 GFP 基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显微 注射、电激转化等方法转化合适的细胞，利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和 信号序列来控制融合基因的表达，在荧光显微观察系统下监测融合蛋白在细胞内的存在状 态。 目的基因 融合基因 转化 表达 荧光显微观察 GFT 五、DNA/蛋白互作技术 （一）DNA/蛋白互作技术 1凝胶阻滞分析：该方法用来研究 DNA 与特异性蛋白的相互作用，通常是放射性标记的 DNA 片段与纯化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。 与游离 DNA 相比，蛋白-DNA 复合物的迁移率将降低，因此，与游离 DNA 相对应，人们将观 察到带中的“阻滞”。 原理：蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针 在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。 应用：该方法可用于检测 DNA 结合蛋白、RNA 结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来 检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。 2酵母单杂交：根据 DNA 结合蛋白(即转录因子)与 DNA 顺式作用元件结合调控报道基因表 达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许 多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的 DNA 结合区(DNA-binding domain BD)和转 录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与 AD 的融合表达载体，在酵 母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域 的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域 的蛋白。 （二）蛋白/蛋白互作技术 1GST pull-down：其基本原理是将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作 为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相 互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过 SDS-PAGE 电泳分析,从而证实两种蛋 白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、 纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。 GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase) 2