冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶基因突变的研究

冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶基因突变的研究 作者：许海燕 作者单位：中国医学科学院阜外心血管病医院，北京 100037 【摘要】 目的: 研究中国人冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶（ MS）基 因突变的情况。方法:应用聚合酶链反应 单链构象多态性分析(PCRSSCP) 以及 DNA 测 序技术,检测 60 例患者 MS 基因中与结构和功能密切相关的 10 个外显子的点突变情况。结 果:除已知的 31 外显子区 3 个 SNP 位点比较常见外, 还发现了 1 个新的点突变,3869 位为 A/G 杂合子（ AG 的错义突变可使 1195 位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸）,此患者的血 浆同型半胱氨酸血水平明显高于正常,为 30.93 molL-1。此外发现 32 内含子 1 个新的 G/T 多态性。结论：MS 某种基因突变可能是影响 MS 酶功能及高同型半胱氨酸血症的原 因之一。 【关键词】 高同型半胱氨酸血症 冠心病 甲硫氨酸合成酶 基因突变 甲硫氨酸合成酶（MS 或 MTR）是同型半胱氨酸代谢途径中的关键酶之一 ,可催化同型 半胱氨酸再甲基化合成甲硫氨酸。高同型半胱氨酸血症与冠心病的发生发展可能有一定关 系。为了研究中国人冠心病并高同型半胱氨酸血症患者 MS 基因突变的情况,我们应用聚合 酶链反应单链构象多态性分析(PCRSSCP) 以及 DNA 测序技术,检测了 60 例冠心病并高 同型半胱氨酸血症患者 MS 基因中 10 个与结构和功能密切相关的外显子的点突变。 1 对象和方法 1.1 研究对象 选取我院住院的冠心病患者（根据临床表现、心电图或冠状动脉造影诊断）中空腹血浆 同型半胱氨酸水平高于 15 molL-1 者 60 例, 实验发现新突变后再选取同型半胱氨酸水平 正常者 19 例作为对照。 1.2 实验方法 1.2.1 基因组 DNA 的提取 采集外周静脉血, 传统酚氯仿法提取基因组 DNA 。 1.2.2 PCR 反应 PCR 扩增 MS 基因第 18、19、20、21 、22、23 、29、30 、31、32 外显子,引物序列和扩增片段见表 1,反应体系包括引物、MgCl2 、dNTP、Taq 酶、基因组 DNA。 1.2.3 SSCP 及测序分析 取 PCR 反应产物 10 l,95变性 10 min,冰上骤冷, 立即上样 于 6% 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶, 垂直电泳仪电泳 610 h 后凝胶银染,观察迁移带型。 电泳显示异常带型的 PCR 反应产物, 经纯化后进行测序分析,测序由北京三博远志生物技术 有限公司完成。 2 结 果 60 例冠心病并高同型半胱氨酸血症患者的 MS 基因 10 个外显子中,31 外显子的 PCR 扩 增片段显示出异常带型,分别进行测序 ,结果显示有 3 个已知的 SNP 位点,包括 3778C/A、3782C/T、3862C/T,均为同义突变,此外发现了 1 个新的点突变,1 例患者在 31 外显子区 3869 位为 A/G 杂合子（测序图见图 1，以上位置为 mRNA 位置）,AG 的错义 突变可使 1 195 位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸, 此患者的血浆同型半胱氨酸血水平为 30.93 molL-1,明显高于正常,而在同型半胱氨酸水平正常者中未显示出同样的异常带型 , 测序也未发现此种突变,并且此例患者其它相关酶亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、胱硫醚 缩合酶(CBS)也未检测出有意义的突变。 32 外显子的 PCR 扩增片段显示出 1 种异常带型, 经测序分析发现为内含子 G/T 多态性, 经核查为一个新的 SNP 位点,但对编码蛋白质没有影 响,同型半胱氨酸水平正常者中也有此多态性。表 1 MS 基因中 10 个外显子的 PCR 引物 序列及扩增片段长度 3 讨 论 研究发现高同型半胱氨酸血症与心脑血管疾病及某些先天畸形有一定关系。同型半胱氨 酸是甲硫氨酸的中间代谢产物,其代谢有转巯基涉及胱硫醚缩合反应和再甲基化生成甲硫氨 酸两种途径,前者需 CBS 催化, 后者需 MS 催化,且在提供甲基的过程中需 MTHFR 的参与。 高同型半胱氨酸血症是由于遗传和环境营养因素多方面造成的,同型半胱氨酸代谢途径中的 关键酶基因突变是其发生的重要遗传因素之一，MS 就是其中之一。MS cDNA 于 1996 年 克隆1,此后研究发现 MS 基因编码区域有 33 个外显子和 32 个内含子,其中 19 至 25 外显 子区与其编码的蛋白质 片状二级结构有关 ,并且为维生素 B12 即钴胺素辅基结合区域,26 至 33 外显子区为编码的蛋白质活性区域, 不同 图 1 31 外显子的测序图 的突变可能会对 MS 酶造成不同的影响2。研究较多的突变位点在 P1173L、D919G, 国内戴崇文等3 研究未发现 A2756G（D919G）与中国人心脑血管病的关系, 但有研究发现 此多态性与先天畸形发病如先天性心脏病有一定关系4。 我们选取了 18、19、20、21、22、23、29、30、31、32 外显子区, 应用 PCRSSCP 及 DNA 测序技术,对 60 例中冠心病并高同型半胱氨酸血症患者进行研究,结果除发现已知 的 31 外显子区 3 个 SNP 位点（无义突变）外 ,还发现了 1 个新的点突变,3869 位(mRNA 位置)为 A/G 杂合子,发生了 AG 的错义突变（I1195V）,此患者血浆同型半胱氨酸水平明 显升高,而同型半胱氨酸水平正常者中未发现此种点突变 ,说明这是一个错义突变,并且此例 患者其它相关酶 MTHFR、CBS 未检测出有意义的突变, 因此发现的新突变与 Hcy 水平升 高可能有关。本研究中没有检测出国外报道中常见的 P1173L 突变, 检测到的已知的 3 个位 点均为无义突变,没有临床意义，另外在 32 内含子发现了 1 个 G/T 多态性，因此 MS 基因 变异在国内外人群可能有种族差异。本研究中新发现的错义突变可能与影响 MS 酶功能及 高同型半胱氨酸血症的发生有关,但在人群中突变率如何及其临床意义尚有待大样本进一步 研究。 【参考文献】 1LECLERC D,CAMPEAU E,GOYETTE P,et al.Human methionine synthase:cDNA cloing and identification of mutations in patients of the cb1G complementation group of folate/cobalamin disordersJ.Hum Mol Genetics,1996,5(12):18671874. 2WATLINS D,RU M,HWANG H Y,et al.Hyperhomocysteinemia due to methionine synthase deficiency,cb1G:structure of the MTR gene,genotype diversity,and recognition of a common mutation,P1173LJ.Am J Hum Genet,2002,71(1):143153. 3戴崇文，张广森 .缺血性心、脑血管疾病患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变频度的研 究J. 中华血液学杂志,2001,22(9),484