基因工程参考答案

名词解释 基因工程：用人工方法, 在体外对 DNA 分子进行切割、连接，组成重组 DNA 分子，再导入生物体内, 并使其在异种生物内复制、表达,从而使受体生物获得新的遗传性状,这一全过程称为基因工程。 （PPT） 限制酶：限制酶是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构 的核酸内切酶。 （P 21 页） DNA 连接酶：DNA 连接酶是一种能够将两段 DNA 拼接起来的酶称为 DNA 连接酶。 （或 DNA 连接酶是一种能够催化双链 DNA 片段紧靠在一起的 3羟基末端与 5磷酸基团末端之间形成 磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶） （P 27 页） DNA 聚合酶：DNA 聚合酶是能够催化 DNA 复制和修复 DNA 分子损伤的一类酶。 （P 30 页） DNA 修饰酶：DNA 修饰酶是一类通过添加或删除化学基团来修饰 DNA 分子的酶，主要有末端脱氧核苷 酸转移酶（简称末端转移酶） 、碱性磷酸酶、T4 噬菌体多核苷酸激酶等。 （P 22 页与网上整理结合） 质粒：质粒是一些存在于微生物细胞染色体外的小型闭合环状双链 DNA 分子，是能够进行独立复制 并保持恒定遗传的复制子。 （P 42 页） 穿梭质粒：穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种 不同的寄主细胞中存活和复制，并可以携带着外源 DNA 在不同物种的细胞之间往返穿梭的质粒载体。 （P 56 页）： 噬菌粒：噬菌粒是一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列。 （P 77 页） 粘粒载体：粘粒又称柯斯质粒，是一类由人工构建的含有 DNA 粘性末端 cos 序列和质粒复制子的 杂种质粒载体。 （P 70 页） M13 噬菌体载体： M13 噬菌体是一种含有 6.4kb 环状单链 DNA 分子的大肠杆菌丝状噬菌体。 （73 页及 PPT） 克隆载体：克隆载体是指具有在细胞内进行自我复制能力的 DNA 分子，是外源基因的运载体，又称 无性繁殖载体。 末端脱氧核苷酸转移酶：末端脱氧核苷酸转移酶是一种来源于小牛胸腺，为核酸末端加上一个同聚 物尾巴的 DNA 修饰酶。 T4 噬菌体多核苷酸激酶：T4 多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase）酶是由 T4 噬菌体的 pseT 基因编码的一种蛋白质。该酶催化 r(是拉丁文不是字母)-磷酸从 ATP 分子转移给 DNA 或 RNA 分子的 5-OH 末端,生成 5P。 碱性磷酸酶：碱性磷酸酶有两种不同来源，一种是从大肠杆菌中纯化出来的细菌碱性磷酸酶，另一 种是从小牛肠中纯化出来的小牛肠碱性磷酸酶。它们的共同特性是能够催化核酸分子脱掉 5磷酸 基团,从而使 DNA（或 RNA）的 5-P 末端转化为 5-OH 末端。 （P 36） 定向克隆：当用两种不同的限制酶消化外源 DNA 时，可以产生非互补突出末端的外缘 DNA 片段，此 种片段可采用定向克隆法，即只以一个方向很容易地将其插入到同样用这两种限制酶进行消化而产 生相匹配粘端的载体当中。 （P 104） DNA 体外重组：DNA 体外重组是将目的基因用 DNA 连接酶在体外连接到合适的载体 DNA 上，这种重新 组合的 DNA 称为重组 DNA。 （P 101） 转化：将带有目的基因的重组质粒 DNA 引入受体细胞的过程。 转染：将带有目的基因的重组噬菌体 DNA 直接引入受体细胞的过程。 转导：将带有目的基因的重组噬菌体 DNA 包装到噬菌体头部成为有感染力的颗粒， 再导入受体细胞 中的过程。 电穿孔转化法：将宿主细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，瞬时提高细 胞膜的通透性周围基质中的 DNA 可渗进细胞 化学转化法：化学药物如氯化钙等的转化 氯化钙法转化细胞 ：细菌处于 0及 CaCl2低渗溶液中时，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热击处理促进细胞吸收 DNA 复合物。适用于大部分大肠杆菌菌株，并具有简单快速、重复性好的优点。 感受态细胞：受体细胞经过电穿孔、CaCl 2 、 RbCl(KCl,铷)等处理后，细胞膜的通透性暂时改变， 允许外源 DNA 分子进入。 放射性探针：是指一段带有放射性同位素标记的、与目的 DNA 或 RNA 片段的序列互补的单链核苷酸， 将它与一个 DNA 片段进行杂交可检测该片段中是否含有目的序列（放射自显影技术） 。 抗生素抗性基因插入失活法：许多质粒载体都含有抗生素抗性基因，这些基因内有某 些酶的识别位 点。当用某种限制酶消化并插入外源目的基因时，抗药性基因将不被表达，从而在药物筛选平板上 培养时，可区分出重组转化子的菌株的方法。 -半乳糖苷酶插入失活法：许多载体带有来自大肠杆菌 Lac 操纵子 DNA 区段（含 -半乳糖苷酶的 头 146 个编码信息和调控序列，还插入了一个多克隆位点） 。而宿主细胞可编码 -半乳糖苷酶 C 端， 两者之间可以实现基因内的互补，成为具有酶学活性的蛋白质。Lac+细菌在有诱导物，异丙基- D-硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色 菌落。当多克隆位点上插入了外源基因时，LacZ 的 N 端片段失活。因此带有重组质粒的细菌将产生 白色菌落。 基因产物鉴定法：通过鉴定产物从而确定所克隆的 DNA 片段或分离的 mRNA 是否是目的片段或其 mRNA。 复制子：DNA 复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的 DNA 单位称为复制子或复制单元 (replicon)。 启动子：是一段能被宿主 RNA 聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的 DNA 序列，是基因表 达调控的重要元件。 终止子：是一段终止 RNA 聚合酶转录的 DNA 序列。转录启动后，RNA 酶沿着 DNA 链移动，持续合成 RNA 链，直到遇到终止信号为止。 起始密码：也称翻译起始密码子，是翻译的起始位点,通常为 AUG（ATG）,是首选的起始密码子，编 码甲硫氨酸，也有极少数生物利用其他密码子作为翻译的起始位点。 终止密码： 即翻译终止密码子，翻译过程中，当核糖体移动遇到终止密码子，核糖体就从 mRNA 上 模板上脱落，终止蛋白质的翻译过程。 密码偏好性：编码氨基酸的密码子具有简并性，而每种生物对同义密码子的选择都有自己的偏好性。 SD 序列：核糖体结合位点，指原核基因转录起始位点下游的一段 DNA 序列，即 SD 序列。 基因定点诱变法：是在体外特异性地取代、插入或缺失 DNA 序列中任何一个特定碱基的技术,包括盒 式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及 PCR 定点诱变等。 电镜 R-环检测法：是一种采用 mRNA 作探针，用于检测具有外源 DNA 插入片段重组体分子的核酸杂 交法。其原理是：在临近双链 DNA 变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，双链的 DNA-RNA 杂 交分子要比双链的 DNA-DNA 分子更稳定。 SOUTHERN BLOT：一种可以用来确定克隆的特定 DNA 序列，判明插入片段来自染色体基因组的哪一 部位，还可以证明是否带有目的基因片段的方法。 1. 基因工程操作步骤 （1）获取外源目的基因. （2）外源目的基因的加工. （3）基因运载体的分离提纯. （4）重组 DNA 分子的形成. （5）重组 DNA 转入受体细胞 （6）重组菌的筛选、鉴定和分析 （7）工程菌的获得和基因产物的分离. 2. 如何将基因信息转化成基因实物? 3. PCR 扩增目的基因的原理及步骤 原理：由于 DNA 在高温下会裂解为两条链，当温度下降后能够复性成为双链，所以可以通过控制温 度的变化，设计引物作为启动子，加入 dNTP 和 taq DNA 聚合酶，可以实现 PCR 体外扩增。 步骤： 1、变性，温度升高至 94oC，DNA 双链裂解为单链； 2、退火(复性）温度下降至 40-60oC，使之与引物结合； 3、延伸，在 72 oC 下，以 dNTP 为原料，按半保留复制和碱基互补配对原则合成新链。 4、重复 1-3. 4.大肠杆菌 DNA 聚合酶 的功能，Klenow 如何获得,有那些特性及用途? 3 功能： 5至 3聚合酶活性 5至 3核酸外切酶活性 3至 5核酸外切酶活性 1 2 3 获得：Klenow 是枯草杆菌蛋白酶裂解完整的 DNA 聚合酶 1 而产生出来的大片段分子，或者通过克隆 技术而得到的单一多肽链，由全酶中去除了 5至 3核酸外切酶活性。 特性：去除了 5至 3核酸外切酶活性,而 5至 3聚合酶活性和 3至 5核酸外切酶活性均不 受影响。 用途：1、补平限制酶切割 DNA 后产生的 3凹端；2、用 32PdNTPPT 对 DNA 片段的 3凹端进行末 端标记；3、在 cDNA 克隆中，用于合成 cDNA 第二链；4、应用 Sanger 双脱氧链末端终止法进行 DNA 测序。 5. 理想质粒的特点？质粒的基本构成(有哪几部分)pBR322 的构成部件？为什么相同复制子的不同 载体不能在同一宿主中共存？ 理想质粒的特点： 1) 具有复制起点（必不可少的基本条件）即具有复制子(Replicon)功能,且复制起始区中没有所需 限制酶切位点 2) 具有两种易被检测的选择性标记 理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，在插入外源 DNA 片断之后所形成的重组质粒 中,至少保留一个强选择标记 3) 具有多种限制酶的单一识别位点 具有多种限制酶单一切点,适用于各种限制酶产生的 DNA 片断的插入,满足克隆需要. 4) 具有尽可能小的相对分子量 分子量小有利于分离纯化,有利于克隆较长 DNA 片断,有利于质粒 DNA 的制备以及使克隆基因的 剂量增加,使限制酶的多重识别位点的机率降低. 5) 应该属于松弛复制型 松弛复制型的质粒载体 DNA 在氯霉素存在下大量扩增其拷贝数,使细胞中克隆基因的剂量增加 6) 应为非传递性质粒。从生物的安全防护考虑。 质粒的组成： 必要区：在必要区中与质粒 DNA 复制有关的基因，他们对质粒的存活及复制功能都极为重要 非必要区：在非必要区中，有直接影响细胞表现，如结合转移，对毒物的抗性等形状的基因存在。 pBR322 质粒是由 3 个不同来源的部分组成。 1、pSF2124 质粒易位子 Tn3 的氨苄青霉素抗性基因（Amp r） 2、pSC101 质粒的四环素抗性基因（Tet r） 3、ColE1 的派生质粒 pMB1 的 DNA 复制起点（ori） 相同复制子的不同载体在细胞内复制时会相互竞争，由于大小不同，复制所需时间不同。较小的载 体所需时间短，经过一段时间的复制后其数量会远超过较大载体，从而将较大载体淘汰掉。所以相 同复制子的不同载体不能共存于同一宿主。 6. 穿梭质粒必备的功能元件。 以穿梭质粒为代表介绍：基因组成元件 1) DNA 复制启始序列，含大肠杆菌和酵母中复制的两套复制子。 2) 选择标记，分为缺陷型 (与宿主基因有关，载体可弥补之，-半乳糖苷酶)和显性两类(增加其 性状，如抗生素抗性，常用)。 3) 启动子 -大小约 12kb，一般活性低，故需强启动子，以及增强子。 4) 分泌信号序列-提高蛋白的分泌?正常不能分泌. 5) 终止子-终止转录 有丝分裂稳定区-保证能够平均分配到子代细胞 7. 质粒、噬菌体、黏粒载体的运载 DNA 能力有多大? 原因是？ 质粒：大小 4KB,一般复制能力 10KB,所以运载能力小于 10KB,一般在 5KB 左右 噬菌体：其头部蛋白质外壳对所包装 DNA 大小有严格要求，只有 75-105%的野生型 DNA 长度(38- 52kb DNA)才能被包装成噬菌体颗粒。故插入型 10KB 左右,取代型 10-20KB,因为噬菌体一般为 48KB 粘粒载体(柯斯质粒)：35-45KB,大到 47KB,小到 31KB 8. 放射性标记探针的各种制备方法 （1）切口平移法 1. 加入微量的 DNase造成断裂，产生缺口 2. DNA 多聚酶附着在切口上，由于该酶的 53外切酶活性，它可以从切口开始沿 53方向逐个地切除脱氧核苷酸。 3. DNA 多聚酶附着在切口上，由于该酶的 53外切酶活性，它可以从切口开始沿 53方向逐个地切除脱氧核苷酸。 4. 切口就不断向右移动，同时切口左侧的新合成的 DNA 链不断延长。 5. 如果加入反应系统的四种 dNTP 中有任何一种或两种是用 3H 或 32P 标记，那么由于切口 平移而新合成的 DNA 链便具有放射性了，而且其碱基序列仍与反应前的 DNA 分子完全 一样，这样就可以用作杂交探针。 （2）引物延伸法 DNA 聚合酶可利用寡核苷酸作引物，沿单链模板起始 DNA 的合成。随机引物可从一些厂家购买，也 可在自动 DNA 合成仪上合成一个八聚体分子集群作为引物。使用一种32PdNTP 和 3 种未标记 的 dNTP 为前体，可合成高比活度的标记 DNA 探针。 5 （3）体外转录合成 以 DNA 为模板在体外制备单链探针主要有两种方法， 1）一种是合成可与克隆于 M13 噬菌体载体上的序列互补的单链 DNA 探针， 2）另一种是将克隆于特定载体的靶序列转录成 RNA 探针。 第二种方法只需用不含 RNA 酶的 DNA 酶便可容易地除去 DNA 模板，故该法成为合成单链探针的 首选方法 而且 RNA 探针与 DNA 形成的杂交体更稳定，也不会被 RNA 酶消化，可用该酶除去非特异结合的探 针 该法应具备以下条件： 线状化重组质粒 DNA 模板。应含平端或 5突出端，质粒 DNA 被限制酶切割完全 （线状化） ， 反应中模板浓度应 约为 20nmol/L 。 重组质粒含有噬菌体强启动子。在插入的外源目的序列的上游 （即多克隆位点的上游）带有来自 SP6、 T7 或 T3 噬菌体的强启动子，下游提供一个限制酶切位点，以便于使重组质粒线状化。 特异性的噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶：SP6 、 T7 或 T3 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 对其相对应的启动子有特异性。当它与线状质粒及 4 种 rNTP 混合温育时，所有的 RNA 转录合成 都起始于强启动子，终止于线状 DNA 末端。 核苷酸浓度：当每种 rNTP 浓度都大于 一定值时， 90% 以上转录物 （RNA）是全长的。一般用 1-32PGTP 和其他 3 种未标记的 rNTP 为前体。 放射性 RNA 探针的合成程序： 用适当限制酶消化制备 2pmol 的模板 DNA； 如需要，可用 DNA 聚合酶处理消化 DNA，以除去突出的 3末端； 用酚：氯仿抽提并用乙醇沉淀模板 DNA 以纯化之； 于微量离心管混合各种反应物，在 37 （T3 、T7 聚合物）或 40 （SP6 聚合物）温育反应 12h； 加入无 RNA 酶的胰 DNA 酶，于 37 温育 15min 以除去 DNA 模板； 抽提，纯化并回收 RNA，贮于 -70 备用。 （4）cDNA 探针的合成 扣除杂交法 若 cDNA 探针需用于筛选 cDNA 文库或基因组文库时，目的系列的浓度应较高，但是检测稀有 mRNA 的 cDNA 克隆是很困难的。为此，可采用所谓扣除杂交的方法，如图 7-8 所示，制取单链标记 cDNA 吸 收探针，使 cDNA 探针中某一特定序列的浓度得以提高。 具体方法是： 用从一种表达目的基因的细胞中提取总 mRNA 作模板，反转录合成放射性标记 cDNA 探针； 再从不表达目的基因的另一种细胞提取总 mRNA，并以 10 倍于标记 cDNA 的量与之充分杂交； 通过羟基磷灰石柱层析将 DNARNA 杂交体与未杂交的标记 cDNA （单链）分开； 未杂交的单链标记 cDNA 再与 mRNA 重复杂交一次，并再经柱层析分开，剩下的单链标记 cDNA 即为吸收探针。 （5）合成寡核苷酸探针 特定序列的单一寡核苷酸探针 较短而简并性较高的成套寡核苷酸探针。这种探针是对少量高度纯化的蛋白质进行测序，并得出 其中一小段氨基酸的序列后，再按照遗传密码的简并性推导而得的寡核苷酸片段，经末端标记后便 可作为杂交探针，如图 7-9 所示。例如一套含有 32 段 （每段长 17 个核苷酸）互不相同的寡核苷 酸，便可囊括编码 Phe Met Glu Trp His Lys Asn 这一肽段的所有编码方式。 较长而简并性较低的成套寡核苷酸探针。 一种是寡核苷酸中只含有对应于每一氨基酸位置的所有可能的密码中的一部分 （即猜测体） ，它含 有最可能与真正的基因相配对的密码子的组合；另一种是在简并位点上带上一个 “中性”碱基，如 次黄苷酸， 酶促磷酸化反应标记合成的寡核苷酸制备探针的过程如下： 7 配制反应混合液 寡核苷酸、 （2-32P）ATP、水等 ，充分混匀； 加入 T4 噬菌体多核苷酸激酶并混匀，于 37 温育 45min； 于 68 将反应液加热 10min 以失活酶； 若探针的浓度符合要求，则对标记探针进行纯化。 9. 放射性抗体检测法筛选重组菌体的原理与简单过程。 原理：通过制备针对该克隆基因的蛋白质产物的抗血清或单克隆抗体，与目的蛋白结合成抗原-抗体 复合物吸附于固体支持物（如聚乙烯薄膜）上，并与用 125I 放射性同位素标记后的第二种抗体一道 温育，通过放射自显影技术测定复合物位置，据此确定在原平板中能够合成抗原的菌落位置。 附：最佳抗体应当是与目的蛋白（抗原）不同表位反应的一组单克隆抗体混合物，或者是不与宿主 成分反应的高滴度多克隆抗体 简单过程： 1) 将转化菌落涂布平板，制备影印的复制平板 2) 把平板放置在氯仿蒸气中处理 3) 将连结在固体支持物上的抗体，缓慢地同溶解的细胞接触，以利于抗原吸附到抗体上 4) 将固体支持物与标记后第二种抗体一道温育 5) 通过放射自显影技术测定抗原-抗体复合物的位置 10. DNA 与质粒连接有那些方法，及其优劣？ （P102-112） 方法主要有：1、粘性末端连接法 2、定向克隆法 3、平末端连接法 4、同聚物加尾法 5、加人工接 头连接法 6、加 DNA 衔接物连接法 7、其他转换末端形式连接法 1) 粘性末端连接法：选用一种对载体 DNA 只具惟一限制位点的限制酶作特异切割，再将外源 DNA 也用同一种限制酶作同样的消化，将载体及外源 DNA 混合后，由于具有相同粘性末端，能够形 成双链结合体，其中单链缺口经 DNA 连接酶封闭后，产生稳定的杂种分子。此外，常需调整连 接反应中两种 DNA 的浓度或用碱性磷酸酶（BAP 或 CIP） ，预先处理线性的载体 DNA 分子，防止 载体自身环化。 优点：经过同一限制酶酶切消化的外源 DNA 与载体 DNA 容易进行退火连接；缺点：酶切后载体 DNA 分子可能发生自身环化作用，也有可能形成串联卦聚物，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价 闭合的环形结构。此外，导入的外源 DNA 有两种彼此相反的取向，对于基因克隆不方便。 2) 定向克隆法：当质粒载体和外源 DNA 片段用同样的限制酶切割时，两种 DNA 能共价地连接起来， 但由此引导的外源 DNA 片段的插入，可以有彼此相反的取向；因此应用两种不同的限制酶消化 外源 DNA，产生带有非互补突出末端的外源 DNA 片段，可以只以一个方向容易地将其插入到用相 同两种限制酶消化而产生相匹配粘性末端的载体中。 优点：载体片段两端突出末端不互补，不能自身环化，与外源 DNA 片段定向重组效率高。 3) 平末端连接法：某些限制酶切割后产生具有平末端的 DNA 片段，可用 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 平末端 DNA 片段互相连接。 优点：对于两种具有不互补粘性末端的 DNA 片段，或是其中一种具平末端，另一种具粘性末端的 DNA 片段，可用 S1 核酸酶修饰成平末端后用 T4 噬菌体 DNA 连接酶连接。缺点：平末端连接属于低 效反应，且重组之后一般不能原位删除。 4) 同聚物加尾法：利用末端脱氧核苷酸转移酶可催化 dNTP 加到单链或双链 DNA 3羟基端的能力， 在目的 DNA 和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可以转化大 肠杆菌的开环重组分子。 优点：可使两个具平末端的 DNA 片段进行连接，也可使具平末端和粘性末端的 DNA 片段连接。缺点： 只对质粒载体有效，所产生 cDNA 文库较难贮存和复制；质粒和 cDNA 上的同聚物长度难于控制相等， 影响克隆效率；用其转化宿主菌的效率依不同菌株有较大差别。 5) 加人工接头连接法：人工接头是化学合成的两个自相互补核苷酸寡聚体，可形成带一个或以上 的酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段。人工接头的 5端经磷酸化后，通过 T4DNA 连接酶与 平末端的外源 DNA 片段连接；具衔接物的载体 DNA 和外源 DNA，用适当限制酶消化后，产生彼此 互补的粘性末端后再连接。 优点：兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优点，且可以根据实验的不同要求，设计出具有不 同限制酶位点的人工接头。缺点：若待克隆的 DNA 片段或基因内部含有与所加人工接头相同的酶切 位点，则在酶切消化人工接头时也会把外源 DNA 切成不同片段，影响后续操作。 6) 加 DNA 衔接物连接法：DNA 衔接物为人工合成的一头为平末端（可与双链目的 DNA 连接） ，另一 头为带有某种限制酶位点粘性末端（可与载体相应粘性端连接）的双链寡核苷酸，它与双链目 的 DNA 连接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载体 DNA 连接。 缺点：反应体系中的 DNA 衔接物因互补粘性末端易形成二聚体分子，具 DNA 衔接物的目的 DNA 易发 生自身环化；需要修饰 DNA 衔接物的粘性末端使之无法形成二聚体。 11. 目的基因合成设计时，需要考虑哪些因素？ 1) 寡聚核苷酸片段划分的长度，一般将基因划分为 3050 核苷酸对的若干个片段 2) 限制酶位点：通过密码子的简并性改换部分密码子，以消除基因内部多余的限制酶位点。 3) 排除基因内部正反向重复序列：正反向重复序列（片段间重叠区）会影响拼接效率 4) 选择表达宿主偏爱的密码子 5) 加起始与终止密码子 6) 基因表达因素；根据所选载体的不同，还要考虑调整合适的阅读框，加核糖体结合位点，加信 号肽与保守序列等。 12 含目的基因重组克隆的五大种筛选方法及其简单原理? 1) 抗生素抗性基因插入失活法：很多质粒载体都带有 1 个或多个抗生素抗性基因标记，在这些抗 药性基因内有酶的识别位点。当用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的 DNA 时，抗药性基因不 再被表达，称为基因插入失活。因此，当此插入外源 DNA 的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择 平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感，便可筛选出重组转化子（重组体） 。 2) -半乳糖苷酶基因插入失活法：许多载体都带有一个来自大肠杆菌的 Lac 操纵子 DNA 区段，基 因含有编码 -半乳糖苷酶 N 端 146 个氨基酸的编码信息（LacZ ）和调控序列（LacI） ，还插入了 一个多克隆位点(不破坏阅读框)。而宿主细胞可编码 -半乳糖苷酶 C 端，两者之间可以实现基因 内的互补（称为 -互补） ，成为具有酶学活性的蛋白质。Lac +细菌在有诱导物异丙基-D-硫代半 乳糖苷（IPTG）和生色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落。 然而，当外源 DNA 片段插入到质粒的多克隆位点后，使 LacZ 的 N 端片段失活，破坏了 互补作 用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落，通过目测就可轻易识别并筛选出可能带有重组质 粒的转化子菌落。 3) 快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法：配制一种破碎细胞缓冲液，其中含有十二烷基硫酸钠（SDS） 和乙二胺四乙酸（EDTA） 。SDS 能溶解膜蛋白使细胞破裂，并解聚核蛋白，还能与蛋白质结合成复合 物，使蛋白质沉淀；EDTA 能螯合金属离子，防止脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用。细胞破碎后 经高速离心，去除细胞碎片和大部分的染色体 DNA 、RNA 、蛋白，得到含有质粒 DNA 的上清液。 将含有质粒 DNA 的上清液 （单菌落溶菌物） ，直接进行点样凝胶电泳和分离测定。在琼脂糖凝 胶电泳上分离，包括染色体 DNA、不同大小的质粒 DNA 以及 RNA，它们都可经肉眼观察或拍照而显 示。一个单菌落会有大量的质粒 DNA，它足以在染色体 DNA 前面形成一条独立的电泳谱带 由于带有外源 DNA 插入序列的相对分子质量较大，其重组体 DNA 比未插入外源 DNA 的相对分子 质量较小的质粒 DNA ，在凝胶中的迁移速度就要缓慢些。根据这种差别，就可以容易地检测出哪些 菌落是含有重组质粒，即具外源 DNA 插入序列的相对分子质量较大的质粒。 4) 放射性标记核酸探针杂交筛选法：核酸分子杂交的原理就是根据单链的 DNA 或 RNA 能与另一 单链 DNA 上和它互补的碱基顺序配对，在一定的条件下，使它们的互补碱基形成氢键，从而使两单 链联结起来成为一种 DNADNA 或 DNARNA 的双链杂交分子。 若两种待杂交 DNA 之一（如目的基因 DNA）是已知的并事先用放射性同位素（ 32P 或 3H）标记， 则可用它作为分子探针来识别或探知另一种 DNA （如重组质粒 DNA）中与其同源的部分（插入质粒 DNA 中的目的基因） ，从而可筛选出带有特定 DNA 顺序（目的基因）的重组子。 5) 免疫化学筛选法：事先制备针对蛋白质产物的抗血清或单克隆抗体，直接检测克隆基因所表达 的蛋白质产物。分为放射性抗体检测法（形成抗原-抗体复合物，与标记后的第二种抗体共同温育后， 通用放射自显影技术测定复合物位置）和免疫沉淀检测法（加入抗某种蛋白质的特异性抗体，若菌 9 落中会分泌出这种蛋白质，则在它周围出现一圈由抗体-抗原沉淀物形成的深沉素带） 。 13目的重组克隆鉴定的六种方法及简单原理? 1) 酶切及凝胶电泳鉴定法：凝胶电泳是分离、鉴定和纯化 DNA 片段的标准方法。该法操作简便、 快速，分辨率高。此外，可直接用溴化乙锭进行染色以确定 DNA 在凝胶中的位置，并直接于紫外灯 下观察 DNA 条带。 鉴定时，先小规模培养细菌，煮沸法或碱裂解法抽提重组质粒 DNA，用原限制酶酶切消化，进行 凝胶电泳分析，用同一限制酶切割的载体和目的 DNA 或已知相对分子质量的 DNA 片段作对照。重组 质粒电泳应有两条带：一条是泳动速度较慢，相对分子质量较大的带（质粒载体 DNA） ，一条是速度 较快分子质量较小的带（目的基因 DNA） 。凝胶电泳可确定重组质粒 DNA 中插入目的 DNA 大小和方向。 2) Southern 印迹杂交法（Southern 印迹法）：该法可确定克隆特定 DNA 序列，判明插入片段来自 染色体基因组的部位及大小，及证明是否带有目的基因. 原理：提取重组菌的质粒 DNA限制酶切琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 用碱变性使双链分开 转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上 探针溶液与 NC 膜混合进行同源性 DNA 杂交 杂交后带有放射性的 DNA 留在硝酸纤维膜上，经放射自显影后，在 X 光底片上出现黑色区带， 证实了该基因片段是目的基因片段。与 DNA 对照带比较，可确定基因片段的大小。 3) 电镜 R-环检测法： R-环检测法是用 mRNA 探针，用于检测具有外源 DNA 插入片段重组体分子的 核酸杂交法。 原理：在临近双链 DNA 变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，双链 DNA-RNA 杂交分子比 双链 DNA-DNA 分子更稳定。因此，将 RNA 及变性 DNA 的混合物置于这种退火条件下，RNA 便会同 DNA 互补序列退火，形成稳定的 DNA-RNA 杂交分子，从而使被取代的另一链处于单链状态。这种单链 DNA 分支和双链 DNA-RNA 分支形成的泡状体，称为 R-环结构，可以在电子显微镜下观察到。所以， 应用 R-环检测法可以鉴定出双链 DNA 中存在的与特定 RNA 分子同源的区域。 4) 基因产物鉴定法：该法是用于鉴定产物是否确是目的基因的产物，从产物的鉴定结果也可进一 步证明所克隆的 DNA 片段或分离的 mRNA 是否是目的基因的基因片段或其 mRNA。常用体外转译法进 行基因产物的鉴定。从细胞中提取的天然 mRNA 或通过克隆化的 DNA 在体外转录产生的 mRNA，在无 细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质，这些体外翻译反应产物可通过免疫沉淀或 SDS 聚丙烯酰胺凝 胶电泳加以分析鉴定。 14、酵母菌基因表达载体的类型（P164） 1) 自主复制型质粒载体（YRP） 自主复制型载体含有酵母基因组的 DNA 复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在 酵母细胞中进行自我复制。在酵母细胞中的转化率较高，每个细胞中的拷贝数可达 200 个，但经过 多代培养后，子细胞的拷贝数会迅速减少。 2) 整合型质粒载体（YIP） 整合型质粒载体不含酵母 DNA 复制起始区，不能在酵母中进行自我复制，但含有整合介导区， 可通过 DNA 的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体 DNA 的同源重组主要有单交换整合和双交换整合两种方式。 3) 着丝粒型质粒载体（YCP） 该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分 裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有 1-2 个 4) 酵母人工染色体（YAC） 该载体在酵母细胞中以线性双链 DNA 的形式存在，每个细胞内只有单拷贝，包含酵母染色体自 主复制序列、着丝粒序列、端粒序列、酵母菌选择标记基因、大肠杆菌复制子和选择标记基因等。 15. 基因定点诱变技术？PCR 定点诱变法及其原理?（P157） 基因定点诱变：在体外特异性地取代、插入或者缺失 DNA 序列中任何一个特定碱基的技术，现 已发展成为基因操作的一种基本技术。目前已发展的定点诱变方法有盒式取代诱变、寡核苷酸引物 诱变及 PCR 定点诱变等。 （详见教材 157） PCR 定点诱变法的原理：PCR 扩增引物与模板 DNA 之间错配的单碱基，在经过扩增之后会掺入到 模板序列中去，最终产生出突变体的双链 DNA 分子。 PCR 定点诱变法中常用的是大引物诱变法，其核心是以第一轮 PCR 扩增产物作为第二轮 PCR 扩增 的大产物，只需 3 种扩增引物进行两轮 PCR 反应即可获得突变体 DNA。 （本题需要画图，图详见教材 161） 16. 双脱氧终止法测定 DNA 序列（P141） 原理：以单链 DNA 为模板，使用特异引物在 DNA 聚合酶作用下进行延伸反应时，若在反应物中 加入一定量的 2,3-双脱氧三磷酸腺苷酸（ddATP） ，则在正在增长的 DNA 链中应当掺入 dATP 的 位置上掺入 ddATP。由于 ddATP 在脱氧核糖的 3位置上缺少一个羟基，不能同后续的 dNTP 形成磷 酸二酯键，因此，正在增长的 DNA 链不可能继续延伸而终止。这样，链延伸将于随机发生但却十分 特异的链终止展开竞争，而反应产物则是一系列以 ddATP 结尾的长短不一的寡核苷酸。 如果在 4 组独立的酶反应中分别采用 4 种不同的 ddNTP，结果将产生 4 组寡核苷酸混合物，他们 将分别终止于模板链的每一个 A，每一个 C，每一个 G 或每一个 T 的位置上。将反应物变性，在可以 区分长度仅差一个核苷酸的条件下，对各族寡核苷酸进行凝胶电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样 于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，既可以在凝胶的放射自显影片上直接读出 DNA 上的核苷酸顺序。 17.菌落原位杂交法筛选重组菌的原理与简单操作步骤。 （P133） 原理：将被筛选的细菌菌落从生长平板转移到铺放在琼脂平板表面的硝酸纤维素滤膜，于适温 下进行培养（保留原菌落为参照）；取出长有菌落的滤膜，用碱液处理以溶解菌落，并使 DNA 变性； 再处理滤膜以除去蛋白质，留下的与滤膜结合的变性 DNA 则在菌落原位上形成 DNA 印迹。在 80下 烘烤滤膜以固定 DNA。将这些滤膜与放射性标记的 DNA 或 RNA 探针杂交，通过放射自显影检测结果。 含有同探针互补的 DNA 的菌落，在 X 光底片上呈现黑色的斑点。 操作步骤：将菌落或噬斑原位转移或影印到硝酸纤维素滤膜上裂解菌落或噬斑并使释放的 DNA 原位结合于滤膜上固定于滤膜上的 DNA 与标记探针进行杂交杂交后滤膜漂洗及放射自 显影 18原核工程菌外源基因高效表达的影响因素？ 1) 强启动子，强启动子有利于提高克隆基因的表达效率 2) SD 序列：SD 序列越保守，表达效率越高。 使 SD 序列与核糖体 16SrRNA 中的碱基完全互补配对；根据不同情况，适当调整 SD 序列与起始 密码子 AUG 间的距离和碱基种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后的 mRNA 形成二级结构等。 3) 密码子的偏好性：大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现出较大的偏爱性。 4) 有无增强子 5) 宿主细胞对外源蛋白的耐受性 6) 宿主细胞吸收氨基酸的能力 19.工程菌表达外源蛋白的种类，及其特点。 （在原核细胞中表达） 1) 包涵体：外源基因的高表达产物在原核细胞中积极，并致密地聚焦在一直形成的一种水不溶性 蛋白质结构。特点是水不溶性，密度远大于其它蛋白，易于分离纯化，对蛋白酶表现较好抗性。 2) 融合蛋白：外源目的蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组而不改变两个基因各自的阅读框，以 这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。特点是稳定性较好，表达效率较高，较易于分离纯化。 3) 寡聚型外源蛋白：构建外源蛋白表达载体时，将