实时荧光定量pcr

实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称 Real Time PCR）是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied biosystems 公司推出，在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个 PCR 进程，使每一个循环变得“ 可见”,最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中 的 DNA（orcDNA）的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量 PCR 是目前确定样品中 DNA（或 cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。如果用于 RNA 检测，这被称为逆转录实时 PCR 即（Real-time RT-PCR）是实时 PCR 法，它是指对 DNA 或经过反转入（RT-PCR ）的 RNA 通过聚合酶链式反应并实时监测 DNA 的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为 扩增指数增长期测量值与特异 DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。 RealTime PCR 的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测 CT 值而实现对原 始目标基因的含量定量。实时荧光定量 PCR 法最大的优点是克服了终点 PCR 法进入平台期或 叫饱和期后定量的较大误差，实现 DNA/RNA 的精确定量。该技术不仅实现了对 DNA/RNA 模板 的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确 等特点。此外，通过在该体系中加入两条或者两条以上引物及对应的探针，便可实现对多种病 原体的同时检测，如硕世公司的手足口及流感的三重检测。因此荧光 PCR 技术在医学临床检验 及临床医学研究方面发挥着越来越重要的作用。 实时定量 PCR 的系统构成及工作原理 荧光定量检测系统由实时荧光定量 PCR 仪，实时荧光定量试剂，通用电脑，自动分析软件 等构成。设备由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计 算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光 强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据 进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的 水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为 Ct 值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数 期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应 浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。 所谓 Real-time Q-PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实 时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR 反应过程中产生的 DNA 拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终 PCR 反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的 PCR 中，常用凝胶电泳分离并 用荧光染色来检测 PCR 反应的最终扩增产物，因此用此终点法对 PCR 产物定量存在不可靠之 处。在 real-timeQ-PCR 中，对整个 PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相 关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在 PCR 反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最 终的平台期，因此可以在 PCR 反应处于指数期的某一点上来检测 PCR 产物的量，并且由此来 推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在 real-timeQ-PCR 反应的指数期，首 先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以 PCR 反应的前 15 个循环的荧 光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是 315 个循环的荧光信号的标准 偏差的 10 倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct ）。Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的 Ct 值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 实时荧光定量 PCR 技术的应用领域 实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA、RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以 得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平 进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别 扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。 目前实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领 域。其中最主要的应用集中在以下几个方面： DNA 或 RNA 的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物拷贝数 的检测，RNAi 基因失活率的检测等。 基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、 物理处理、化学处理等），特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 或差显结果的确证。 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。 实时荧光定量 PCR 技术在医疗方面的应用 病原体检测：目前，采用荧光定量 PCR 检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、 人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒、结核杆菌、细小病毒 B19、EB 病毒和人巨细胞病 毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。 遗传及优生优育诊断：到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗， 只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少 X 连锁遗传病患 儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿 DNA,用实时荧光定量 PCR 检测其 Y 性别决定区基因是 一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。例外还可以通过实时荧光定量 PCR 对孕妇弓形虫，梅 毒等检测，这对找出不明原因流产和习惯性流产的病因提供有力的帮助，大大提高优生优育。 指导治疗：对病原体定量分析显示：病原体量与某些药物的疗效关系。如 HCV 高水平表达， 干扰素治疗作用不敏感，而 HCV 低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV- DNA 的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异等。 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本 原因已被广泛接受。p53 癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时