干细胞生物学文献翻译

92229227 | PNAS | May 18, 2010 | vol. 107 | no. 20 与鼠胚胎干细胞有着相似的生物学和表观遗传特性的 人胚胎干细胞 翻译：周驹俊 摘要： 人与鼠的胚胎干细胞（ESCs）都来源于囊胚期的胚胎，两者却有着十分不同的生物学 特征。分子水平上的分析表明人源的ESCs与鼠来源的上胚层干细胞（EpiSCs）相对应。这 里我们通过让人ESCs重新进入一个更加不成熟的状态，使之与多能性鼠ESCs 拥有广泛相似 的性质。这种状态是通过异位诱导表达Oct4,、Klf4、Klf2因子以及联合表达 LIF、糖原合成 酶激酶3 （GSK3）抑制因子和丝裂原激活的蛋白激酶（ (ERK1/2）通路实现的。Forskolin 是一种蛋白激酶A,通过它可以诱导Klf4 和Klf2的表达并且可以短时间地替代异位转基因表 达。与传统的人ESCs不同的是，这些表型转变的细胞在生长特性、X-染色体基因激活位点、 基因表达谱以及对信号途径的依赖等方面与鼠ESCs有着高度相似。这样，在相同的生长条 件下将可以使衍生得到的人诱导多能干细胞（iPS）与鼠 iPS细胞有着相同的性质。初始多 能性人ESCs的建立使得原先人中未阐明的多能性状态得到分子水平上的进一步细分，同时 也为病人特异性和疾病相关的研究提供了新的机遇。 概述: 鼠胚胎干细胞（mESCs）来源于发育中的胚胎的内细胞团（ICM），可以在体外培养的 条件下无限增殖并保持其多能性，所以 ICM在被移植进入宿主胚胎时也保留了参与成体细 胞发育的潜能。最近，研究人员从移植后的小鼠胚胎外胚层中得到了一种新的类型的多能 性细胞即上胚层干细胞（mEpiSCs）。mESCs和mEpiSCs在分子水平和表观方面有着明显区别， 他们分别代表了最近定义的初始多能性状态和始发多能性状态。ICM来源的初始多能性干细 胞能够有效地参与嵌合体胚胎的形成，在雌性细胞中维持X染色体的活性状态并且在体外相 对较难于分化为原生殖细胞（PGCs）。mEpiSCs即始发态多能干细胞可以产生已经分化了的 畸胎瘤，但是重新聚集为ICM的效率低下，具有有显著的X-染色体失活（XiXa）和在体外可 以分化成PGC前体的特征。初始mESCs能够高效增殖并长成紧密的球形克隆，LIF/Stat3可以 稳定维持其干细胞特性而bFGF和TGF/Activin信号通路则使其分化。不同的是，始发态 mEpiSCs却有着扁平的细胞克隆形态特征，不能够以单个细胞来传代而且其稳定性依赖于 bFGF和TGF/Activin信号通路而不是依赖于LIF/Stat3。来源于129小鼠品系的EpiSCs处于 LIF/Stat3信号环境中能够逆转回初始状态，而且Klf4,klf2,Nanog和c-MYC干性因子的表达 能够使这一逆转过程得到增强。 之前认为从非肥胖糖尿病（NOD）小鼠或者大鼠品系的ESC中分化出初始多能干细胞是 不可能的，但通过在培养基中添加那些可以缓解抑制分化的小分子和生长因子或者通过加 强那些可以稳定初始多能性的核心通路却使得这一转化得以实现例如，GSK3、促分 裂原活化蛋白激酶通路(ERK1/20和LIF/STAT3引起的KLF4和c-MYC的外源组成型表达。遗传 决定补偿可能对于某一品系或者种属来说是特有的，但对于初始多能性细胞的繁殖却不是 唯一的，这很好的解释了前述条件对于遗传决定的补偿。由于从NOD小鼠或大鼠中都可以分 离得到EpiSCs，这很明显的说明了遗传决定并不干扰干细胞的始发多能性状态。通过重编 程或植入前囊胚得到的NOD初始多能性细胞处于高度亚稳定状态，当撤去外源支持因子和添 加bFGF/Activin的条件下将采取一种始发（Primed）多能性状态。 人ESCs与mEpiSCs尽管不完全一样却有着许多特定的相似特称，并与初始mESCs有着明 显区别。mEpiSCs和hESCs有着相似得扁平细胞形态，都不能够作为单个细胞传代，都于依 赖TGF/Activin信号通路维持稳定以及都有着来源于雌性细胞系的X染色体失活和在体外 存在BMP4的条件下极易向PGCs分化得特征。hESCs和mEpiSCs之间的相似性以及前述的初始 NOD多能干细胞的高度亚稳性强调了建立和维持人来源细胞的始发多能性的可能性，同时也 反映出用增殖hESCs的传统培养条件来维持初始多能性状态有着其内在的不稳定性。这些发 现也引发有关于对于体外分离的hESCs和人诱导多能干细胞（(hiPSCs)性质的一系列更深入 的问题：用于分离NOD mESCs的相同的外源因子能够帮助建立和维持类似鼠ESC的人初始多 能性干细胞吗？或者人来源细胞的允许度更小并需要操作而外或不一样的信号通路？在本 研究中，我们参照分子与功能的标准，看能否找到体外稳定人多能性状态的因子并且这种 多能性细胞与初始mESCs有着相似的特征。在本研究中描述的培养条件，可以分离得到初始 hiPSCs，并且可以实现有传统hESCs向初始多能性状态的表观遗传转变。我们的发现证实了 之前没有确认的人初始多能性干细胞这一状态。 结果： 人初始多能性干细胞状态的稳定维持。为了验证能够稳定小鼠NOD和大鼠ESCs的条件 是否否在体外也能影响人多能干细胞的性质，我们以之前描述的人女性C1次级成纤维细胞 为材料通过各种条件来诱导hiPSCs( Fig. 1A)。构建好的C1次级成纤维细胞系稳定转染了多 西环素诱导表达OCT4、SOX2和KLF4这三种重编程因子的慢病毒载体和一个组成型持续表达 的四环素反式激活因子。在无血清培养基N2B27联合ERK1/2抑制剂PD0325901 (PD)、GSK3抑 制剂CHIR99021 (CH)和LIF（简称为PD/CH/LIF）三种因子的条件下培养14-25天，开始出现 初始mESCs样细胞形态，并且这类细胞可以在添加了DOX和PD/CH/LIF的培养基中维持（ Fig. 1A）。 当将培养在bFGF血清培养基不依赖DOX的C1 hiPSC细胞系转移到N2B27 PD/CH/LIF + DOX的 培养基中培养5-7天后，可以得到上述相似得克隆( Fig. 1B)。收集单个的初始样C1 hiPSC 细胞在含有DOX和抑制剂的培养条件下，通过胰蛋白酶处理可传代超过50代。这些细胞系在 形态上和mESCs几乎没有差别( Fig. 1A)，在传代过程中保持正常的核型( Fig. S1B)，表达 人多能性标记( Fig. S1C)，呈现前X染色体失活的表观特征（XaXa）( Fig. S3A)，能分化产 生畸胎瘤( Fig. S1D)，对bFGF和Activin/Nodal信号通路抑制或者添加BMP4敏感( Fig. 1C)， 而这些特征都与小鼠ESCs相类似。但与NOD小鼠来源的iPSCs可以在不依赖于DOX的诱导条件 下培养不一样的是，这些C1初始样 hiPSCs在撤去DOX之后会迅速分化 (Fig.1A and E)。组 成型的表达KLF4和OCT4或者KLF4和KLF2对于培养在PD/CH/LIF 条件下的C1 hiPSCs是必须的 (Fig. 1D)。同样，BGO1或者WIBR3 hESCs在稳定转染了OCT4和KLF4基因并N2B7添加 PD/CH/LIF的培养条件下诱导培养( Fig. S4)得到了稳定的多能细胞系，这些细胞系有着稳 定的核型，可以分化成畸胎瘤( Fig. S4 A and B)，也需要外源异位基因的表达和 PD/CH/LIF维持稳定( Fig. S4E)。这些结果表明人类细胞比NOD小鼠细胞有着更小的许可度， 因子需要外源的因子来稳定体外的初始干细胞状态。 建立好的依赖于DOX的初始C1.2 hiPSC细胞系之后被用来筛选在撤去DOX后，其它的能 够稳定C1.2 hiPSCs的复合物和生长因子，这些筛选条件都是在N2B27 PD/CH/LIF培养条件 下进行的筛选（Fig E）。我们也将之前文献报道的能够维持初始mESCs多能性的复合物也 做了筛选，包括TGF(SB431542, RepSox, A83-01)和FGF 酪氨酸激酶受体信号通路的抑制 剂（(PD173074），BMP4，IL-6或者KLF4/KLF2的替代物（Kenpaullone, BIX01294, BayK8644, Forskolin, and AICAR)。这些复合物的联合作用（称为 13i + LIF的联合）使 得C1.2 hiPSCs i在缺乏DOX的情况下能够稳定维持。通过一次只减少一种抑制剂的方法， 我们鉴定出PD,CH和Forskolin (FK)是这些混合物中的关键抑制剂（）Fig.1E。之前， FK 由于能够增加细胞内cAMP的水平并随后激活蛋白激酶A(PKA)而被用于胚胎生殖细胞的增殖。 FK至少通过部分地诱导Klf2和Klf4来维持C1 hiPSCs在不依赖于DOX的情况下的稳定( Fig. S5)。我们测试了PD/CH/LIF/FK联合外源基因的诱导是否能够逆转WIBR3 hESC细胞系进入初 始多能性状态。WIBR3 hESCs转入了外源Oct4和Klf4或Klf4和Klf2基因，并在PD/CH/LIF/FK 条件下培养( Fig. 2A)。8-12天后，隆起的球星克隆开始出现，这与典型的初始mESCs相类 似 (Fig. 2A and Fig. S6A)。这些克隆被收集，用胰酶消化后在PD/CH/LIF/FK培养条件 下传代。因为这些细胞系在形态上与初始mESCs相似，我们定义这些细胞系为初始 hESCs（初始WIBR3.1 3.5）和初始hiPSCs。 初始hESCs 和初始hiPSCs都是多能性的。初始hESC/hiPSC细胞系的培养在添加 了PD/CH/LIF/FK的培养基当中，通过胰酶消化传代，并保持正常的核型 (Fig. S6B)。初始 hESCs和 hiPSCs在胰酶消化后单个细胞的传代效率 85%，这与 mESCs的高克隆效率一致 (Fig. 2B)。相反的，传统的hESCs 和hiPSCs的克隆效率低下（(5%)），或者在Rho 激酶 （ROCK）抑制剂存在条件下有着20% 的效率( Fig. 2B)。初始 hESCs的细胞加倍时间稍微减 少了20%( Fig. 2C)。这些初始细胞有着阳性的多能性分子标记( Fig. S6C)并且Oct4和Nanog基 因启动子区域 的甲基化水平明显低于成体成纤维细胞( Fig. S6D)。为了测定初始hESCs/hiPSCs在体外的分 化能力，我们用悬浮培养的方法使之形成拟胚体（EBs）。悬浮培养7天后，RT-PCR的结 果证实了这些EB分化的细胞表达了各个胚层的分子标记 (Fig. S7A)。初始hESCs/hiPSCs 在成 体组织中形成的畸胎瘤代表了来源于三个胚层的分化( Fig. S7B)。初始hiPSCs在体外也能被 诱导分化为神经细胞( Fig. S7C)。不同于那些异位表达转基因的初始多能性细胞可以在 PD/CH/LIF培养基条件下传代超过50代( Fig. S1B)，那些在遗传上修饰过的依赖于 FK的初始 nave hESCs却不能够维持超过15-20 代，而这可能是由于这些复合物的细胞毒性或者这些复 合物并不能够完全代替外源基因的表达作用所引起的( Fig. 1)。 初始hESCs 是否与mESCs 有着共同的特征，而且依此构建细胞的一种区别于传统的 hESCs的多能性状态。不同于hESCs和mEpiSCs在ERK信号通路受到抑制后就会分化，ICM 来源的mESCs在抑制了 ERK1/2信号通路后会更加稳定。与之前的研究相一致的是，传统的 hESCs不能够在抑制了ERK1/2 信号通路的培养条件下增殖 (Fig. 3A)。而初始hESCs 与NOD来 源的mESCs 有依赖于 ERK1的抑制来维持稳定 (Fig. 3A and Figs. S2A and S8A)。同样的，初 始hESCs 依赖于 LIF信号通路，表现出Stat3的高度磷酸化（pStat3）( Fig. S8B)，并且在JAK 抑制剂阻断了Stat3的磷酸化后就会分化。这些表型与mESCs类似而与 hESCs对于JAKi 的耐 受相反( Fig. 3A)。同样的，当稳定转染显性抑制 Stat3的外源基因后，初始hESCs 迅速分化而 转入组成型表达激活的Stat3突变基因后却可以在不依赖于 LIF的情况下增殖( Fig. S8C)。而 且，hESCs 和mEpiSCs在被SB431542或SB431542 抑制了TGF/Activin 信号通路后便迅速分 化，而mESCs和初始 hESCs/hiPSCs却在相同条件下维持稳定，在加入 TGF后发生分化( Fig. 3A)。同样的，添加 BMP4生长因子或者bFGF 信号的抑制剂也造成了相同的结果( Fig. 3A)。 mEpiSCs和hESCs 都处于一种即将分化为 PGC样的细胞，在 BMP4的刺激下容易激活产 生生殖细胞表面的标记如DAZL,BLIMP1 和VASA 。在mESCs中却不能激活这些分子标记， 而是需要先产生拟胚体之后才发生PGC样分化。我们测试了这些初始hESCs 是否能够像 mESCs那样可以抵制激活 PGC的分子标记。 Fig. 3B显示， hESCs在BMP4刺激下， VASA,BLIMP1和DAZL 这些分子标记极易产生，而初始 hESCs则没有检测到这些分子标记的 表达上调。用VASA-EGFP 作为报告基因的检测，也得到了相似得 PGC分化结果( Fig. S9A)。 总之，mESCs 和初始 hESC有着一致的生物学功能并且都有相似得信号通路。然而这些通路 却与传统hESCs和mEpiSCs 不同，这表明以上两种不同的多能性状态至少可以通过在小鼠和 人细胞中相似的途径来调控。 在雌性初始hESCs中的表观遗传转变和X染色体激活的维持。 X染色体 失活代表了两种不同的多能性状态：在雌性mESCs中两条X 染色体都保持着活性状态(XiXa) ， 而在mEpiSC和大多数hESCs 都已经处于 X染色体失活(XiXa)。近期，我们阐明了在hESCs 发 生的早期阶段，那些诸如氧化应激的刺激环境可以诱导过早和不可逆的X染色体失活。X 失 活在小鼠细胞中是可逆的，因为通过对XiXa的成体细胞重编程为多能性的细胞后，已经重 新激活了已经沉默了的X染色体。 Fig. 3C 表明WIBR3 hESCs培养在含有20% 氧浓度的bFGF 血清培养基中或者培养在添加了PD/CH/LIF/FK的培养基中 72h后在所有细胞都表达了 XIST，而XIST的表达表明了X染色体的失活。然而，在八种独立来源的初始WIBR3 hESC 和初始hiPSC细胞系中却没有XIST 的表达( Fig. 3C and Fig. S3A)，这与XIST启动子区域的甲 基化相一致( Fig. S3D)。当初始 hESCs转移至bFGF 血清培养基中培养后，这些细胞就变成了 传统hESCs 样的扁平细胞形态。这些发生转变的细胞即始发态多能干细胞，已经起始了X染 色体失活，这可以被XIST的表达和 XIST启动子区域甲基化水平的变化所证明 (Fig. S3 A, B, and D)。总之，这些结果表明，与小鼠细胞相类似，X染色体失活状态在始发态干细胞被转 化为初始hESCs细胞的过程中是可逆，并在初始hESCs中维持激活状态。 初始hESCs 与mESCs有着相似的转录图谱 初始hESCs 与mESCs 有着相似的转录模式。为了定义初始hESCs 的鲜明特征， 我们比较了其与hESCs, mESCs和mEpiSCs在全基因组表达的模式。 Fig. S9B 表明，四种r nave hESC细胞系和两种初始hiPSC细胞系聚类在一块并与hESCs和hiPSCs细胞不同。基因 芯片分析和RT-PCR 的结果表明 hESCs/hiPSCs 和初始hESCs/hiPSCs 的Oct3/4和Sox2表达水 平一样，但与初始mESCs相联系的 Klf4，Klf2, Tbx3，Gbx2，Lin28和SOCS3的表达在初始 hESCs/hiPSCs中却显著上调了( Fig. 4A and Fig. S9 C and D)。相反的，那些在上胚层、早起 生殖层和hESCs中表达的基因在初始hESCs/hiPSCs中显著下调。这些下调基因包括Otx2, Sox17, Cer1, Foxa2, Zic1, Lhx2和XIST ( Fig. 4A and Fig. S9C)。hESCs/hiPSCs和初始 hESCs/hiPSCs在表达上的差别与之前所报导的在mESCs和mEpiSCs上的差别相一致。荧光 激活细胞分选（FACS）分析表明hESCs和mEpiSCs的分子表面已经开始表达MHC一类蛋白， 而这些蛋白在体细胞中普遍表达。与之相反的是，mESCs和初始hESCs/hiPSCs表面只表达 一些与更加不成熟的状态相对应的残基( Fig. 4B)。 我们用无差别跨种属等级聚类的方法来评估人类细胞中初始和始发多能性状态是否广 泛地与之前定义过的鼠中细胞相一致。之后，对24中不同多能性细胞系做了比较( Fig. 4C)， 包括hESCs/hiPSCs，初始hESCs/hiPSCs，129 mESCs和EpiSCs，NOD mESCs，NOD mEpiSC样细胞系。对9949种在人鼠中同源的基因进行跨种属基因表达分析发现这些基因表 达主要聚类为两大组， Fig. 4C表示了所聚类的两大组分别所对应的多能性状态。无论什么遗 传背景和生长条件，所有的初始hESCs/hiPSCs与mESCs和miPSCs都聚类在一块( Fig. 4C)。特 别的，hESCs 和 hiPSCs与小鼠 EpiSCs和NOD EpiSC样细胞聚类在一块。而且初始 hiPSCs/ESCs和hESCs/hiPSCs是反相关的关系，正如相关矩阵中的蓝线表示的一样( Fig. 4C and Fig. S9D)。最后，我们测定了初始hESCs/hiPSCs中 Oct4基因远端与近端增强子区域 的活性。在初始hESCs/hiPSCs中，检测到了Oct4远端基因在表达中占支配地位，而这表明 了在初始hESCs表达网络中Oct4远端增强子的运用与mESCs中类似( Fig. S9E)。 讨论 我们的结果阐明了在生长性质，所依赖的信号途径，X 染色体失活以及转录模式上， 初始hESCs/hiPSCs与传统的hESCs/hiPSCs和mEpiSCs有着明显的区别，而和ICM来源的 mESCs有着相似的多能性状态。这些发现也和如下观点一致即不同的多能性状态能够通过 特定的培养条件来实现，但是种属间的差异和遗传背景的不同决定了需要多少外源因子来 维持初始多能性状态。正如 Fig. 5中所示，129小鼠细胞系有着最高的允许度，因为只需激 活的LIF/Stat3信号通路便足以稳定ICM来源的mESCs 在不同的饲养层细胞中维持稳定。而 具有NOD 遗传背景的则具有较小的允许度，因为其需要组成型表达Klf4或c-Myc，或Wnt信 号通路的刺激因子和ERK1/2 通路的抑制因子来维持其ICM 来源的ESCs 的初始多能性状态。 最后，人类细胞来源的初始多能性有着最小的允许度，因为初始hESCs的获得效率最为低 下，并且需要干扰加额外的信号途径来实现随机的表观转变和维持初始多能性状态( Fig. 5)。 在缺少这些外源因子和内源转录因子的条件下，当维持在bFGF/Activin信号通路下，初始 hESCs就会分化为EpiSC样或者始发态多能性状态( Fig. 5)。弄明白后者的效应是否是传统 hESCs和 hiPSCs之间基因表达的异质性和不同的分化模式的基础是很重要的一个科学问题 (Fig. S9B)。而且，通过对初始和始发态C1 hiPSC lines 的 Southern杂交结果表明，始发态与 初始态之间的转变并不是一种对已经存在的细胞的简单选择。 我们的结果进一步支持了以往认为的KLF转录网路在建立和维持初始多能性中的调节 作用。因此，弄明白是什么遗传因子决定了在不同种属与细胞系之间需要不同的条件来维 持初始多能性状态就显得十分重要，而且是否不同种属间KLF基因的调节的不同区域或者 转录调节基因反映了它们在早起发育中的差别。而且，这些结果也表明不同来源的体外扩 增的多能性细胞，可能影响到为了保持其初始多能性需要不同的外源因子。 需要强调的是，mESCs和初始人多能干细胞之间的可能存在差异，而我们的工作却没 有鉴定出来。而且，也需要优化培养条件来维持初始hESCs 的多能性状态，最终达到在没 有基因操作的前提下能够永久维持其初始多能性状态的目的，并且需要检测这些条件是否 也能够运用到其它物种上。通过阻断Activin/Nodal信号、FGF4受体的自磷酸化和p38信号 抑制可能通路能够进一步增强初始多能性中心转录网络并有很大可能稳定初始多能性。最 后，对人初始多能性细胞状态与特征的鉴定，对于人们在体内体外将人胚胎干细胞和iPSCs 应用于再生医学和疾病模型的研究提供了更广泛的思路。 材料与方法 初始hESCs 的培养。 初始hESCs 培养在无血清的N2B27培养基中。培养基配方如下：240 mL DMEM/F12(Invitrogen; 11320)，240 mL Neurobasal(Invitrogen; 21103)，5 mL N2 (Invitrogen; 17502048)，10 mL B27添加剂(Invitrogen; 17504044)，10ug人重组LIF(Millipore; LIF1005)，1 mM 谷氨酸(Invitrogen)，1%非必须氨基酸(Invitrogen) ，0.1 mM-ME(Sigma), 青霉素-链霉素(Invitrogen)，5 mg/mL BSA (Sigma)和一些如下所述的小分子抑制剂。初 始hESCs/hiPSCs维持在丝裂霉素-C激活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中，并每 5-10天公国 胰酶消化得到单细胞传代。小分子和细胞因子购置于Tocris，Calbiochem，Stemgent,或其它 公司，各因子工作浓度如下：JAK抑制剂 (JAKi, 6 M), Kenpaullone (KP, 5 M), PD0325901 (PD, 1 M), CHIR99021 (CH, 3 M), forskolin (FK, 10 M), FGF4受体抑制剂 PD173074 (0.1 M) 和 SU5401 (2 M), TGF/ALK 抑制剂A83-01 (1 M), RepSox (1 M), 和 ALK 抑制剂 (ALKi; SB431542, 2 M), AICAR (0.5 mM), BixO1294 (1 M), BayK8644 (1 M), BMP4 (10 ng/mL), IL-6 (10 ng/mL)，和人源重组型 TGF (500 ng/mL).详细的实验程序记录于补充材 料SI 中。 Fig 1 小鼠 ESCs 样初始人多能干细胞的获得。 (A)图示为 C1 细胞系及得到之后重编程过程 中不同阶段的传代所得细胞系 C1.2 的策略；p，代表传代次数。图中也展示了 NOD mESCs 和 C1.2 hiPSCs 在撤去 DOX 后的细胞培养情况。 （B）将培养在 bFGF 血清培养基中 C1 hiPSC 细 胞系的 C1 hiPSC 转移至 N2B27 PD/CH/LIF + DOX 培养基中并将之后出现的克隆作亚克隆。图示 为 C1.10 hiPSC 克隆 （C）不同多能性细胞系所依赖的信号途径比较。各种多能性细胞被平均 分配并在指定的饲养层细胞培养，从而使得各种细胞系能够均一化地传代。36h 后，各皿细胞 添加如图所示的抑制剂或者生长因子。处理 6 天后，将各皿细胞固定并针对 Nango 染色从而测 定多能性克隆的相对比例。克隆形成效率通过与没有添加抑制剂的对照组比较而得到均一化。 （D） 将指定表达各种重编程因子的载体通过电穿孔方法转染进入 C1.2 hiPSC 细胞系并在含有嘌呤霉 素（起筛选作用）和 PD/CH/LIF 但没有 DOX 的培养基中培养。图中百分比表示的 SSEA4+克隆相 较于对照组（转染了表达 Oct4/Klf4/Sox 多顺反子的载体）的比例。（E）在 PD/CH/LIF 培养条 件下，筛选不依赖于外源转基因（如不依赖于 DOX）并使得 C1 hiPSCs 增殖的因子。图中所示 为分别以下 13 个因子中的分别去掉其中一个因子后对 C1 hiPSCs 在不依赖 DOX 情况下多能性的 影响。C1 细胞培养在含有饲养层和指定因子的培养基中。用 t-test 所得的 P 值表示实验组与 培养在 DOX/PD/CH/LIF 条件下（100%存活）的对照组有着显著差异。 Fig 2 初始hESC的性质。 （A）使 hESCs转变为初始hESCs的策略。显微 图片为PD/CH/LIF/FK四因子对WIBR3 进行转变所处的不同阶段。P，表示 传代次数。放大倍数如图所示。 （B）通过测定培养7天后所含Nanog 细胞克隆数，测定不同多能性干细胞 的单细胞克隆效率。 （C）细胞加倍 时间估计。每盘细胞分成三份传代， 并分别测定传代后第1,4,7天的细胞 数并用增加的细胞数来估计细胞加倍 的平均时间。误差棒表示SD，用t- test所得的P值表示hESC/hiPSC和初 始hESC/hiPSC细胞系细胞倍增时间有 显著差异。 Fig 3 初始hESCs与mESCs有着相似的信号 途径和表观特征。（A）用Fig 1C相同的方 法测定不同多能性细胞系对信号的依赖。培 养7天后，固定细胞并染色测定含有多能性分 子标记的阳性克隆。SSEA1染色用于测定小鼠 干细胞的阳性克隆率。克隆形成效率通过与 不加抑制剂的对照组（左边第一列）比较而 得到均一化。均一化后低于5%的被定义为对 所加抑制剂敏感。 （B）在有或没有 BMP4/7/8细胞因子条件下，通过RT-PCR检测 早期生殖细胞的分子标记。 （C）XIST RNA（红色）和Cot1核RNA(绿色)荧光原位杂 交（FISH）的结果。Pri-WIBR3.2细胞系在传 统bFGF血清培养基传代后进行了检测。数字 代表XIST阳性占总计数的百分比。 Fig 4 初始hESCs/hiPSCs与mESCs有着相似的转录模式。（A）长条图所示为hESCs和mESCs中 多能性和细胞系特异分子标记的表达中值。用星号标记的基因表示初始和始发态两组比较所得 的FDR值小于0.1。 （B）人和小鼠表面MHC I类分子表达的FACS分析。黑色线条表示同种型的 对照。MFI表示荧光强度中值。（P0.01） （C）跨种属基因表达聚类分析表明，mESCs和nave hESCs与mEpiSCs和hESCs聚类成不同的两组。右边图中黄色和蓝色分别代表正相关与负相关。基 因表达的相对丰度通过Spearman相关和平均连接法聚类得到。小鼠样品用紫色标记，人的样品 用棕色标记。 Fig 5 不同多能性细胞的亚稳状态。 图示 为体外稳定初始态（ICM样或ESC样）和始发态 （上胚层样或EpiSC样）多能性状态之间不同 遗传背景和维持稳定所需因子之间的关系模型。 “亚稳度”可以用来描述体外存在两种或者以 上状态并且各种状态之间可以通过特定信号引 起相互转变的系统。能够引起不同不同物种和 细胞系多能性状态相互转变和稳定其对应多能 性状态的细胞因子和培养添加物在图中已经重 点标记。 Reference 1. 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