心衰患者中血清ghrelin水平及意义

、 研究目的和主要研究内容 Ghrelin 在 99 年被证实为生长激素促分泌激素受体（GHSR）的天然配体，随后的研究进一 步证实 ghrelin 对心血管系统有重要的保护作用。本课题通过检测不同心衰程度患者血清中 ghrelin 的水平，与对照组比较是否存在差异，其水平的高低是否与心衰程度存在联系，以 及随访心衰患者 2 年，观察其与心衰患者的预后及其他心血管事件的关系。 二、研究背景和依据（国内外研究现状、发展趋势、必要性、新颖 性、创新点、研究意 义 ） 二 、 研 究 背 景 和 依 据 （ 国 内 外 研 究 现 状 、 发 展 趋 势 、 必 要 性 、 新 颖 性 、 创 新 点 、 研 究 意 义 ） 心 力 衰 竭 是 各 种 心 脏 疾 患 引 起 的 心 脏 结 构 ， 功 能 异 常 ， 损 害 心 室 充 盈 和 / 或 射 血 功 能 ， 导 致 心 排 出 量 降 低 ， 静 脉 压 增 高 ， 并 伴 有 衰 竭 心 脏 进 行 性 恶 化 和 心 肌 细 胞 过 早 死 亡 的 分 子 异 常 的 临 床 综 合 症 。 其 病 情 复 杂 ， 预 后 不 良 。 严 重 者 一 年 内 病 死 率 高 达 50%以 上 。 据 欧 洲 心 脏 病 学 会 (ESC)统 计 ： 欧 洲 47 个 国 家 的 10 亿 人 口 中 ， 心 衰 患 者 约 占 总 人 口 的 5%， 50 岁 年 龄 段 心 衰 的 患 病 率 为 1%， 80 岁 年 龄 段 已 升 至 10%， 在 85 94 岁 年 龄 段 则 为 4.0%， 25%的 男 患 者 和 38%的 女 患 者 存 活 5 年 ， 住 院 治 疗 心 衰 患 者 的 年 均 死 亡 率 高 达 30% 50%。 在 美 国 ， 约 有 500 万 心 力 衰 竭 患 者 ， 每 年 近 50 万 人 首 次 诊 断 为 心 力 衰 竭 ， 约 有 30 万 患 者 因 心 力 衰 竭 而 死 亡 1。 而 据 阜 外 心 血 管 病 医 院 抽 样 调 查 显 示 ， 我 国 的 心 衰 患 病 率 为 0.9 2。 中 国 部 分 地 区 1980、 1990、 2000 年 慢 性 心 力 衰 竭 住 院 病 例 回 顾 性 调 查 先 后 对 国 内 42 家 医 院 1980、 1990、 2000 年 3 个 全 年 段 住 院 病 历 进 行 回 顾 性 分 析 和 比 较 ， 共 10714 例 心 衰 患 者 入 选 ， 占 住 院 心 血 管 病 患 者 的 16.3 17.9 ， 其 中 男 性 占 56.7 (男 性 多 于 女 性 ， P 60 岁 以 上 患 者 超 过 60 ， 心 衰 病 种 主 要 是 冠 心 病 、 风 湿 性 心 瓣 膜 病 、 高 血 压 病 ； 1980 2000 年 冠 心 病 从 36.8 增 至 45.6 ， 高 血 压 从 8.0 升 至 12.9 ， 风 心 病 由 34.4 减 至 18.6 (均 为 P0.001)3。 我 国 心 衰 的 死 亡 率 高 达 40%， 5 年 存 活 率 与 恶 性 肿 瘤 相 仿 4。 据 以 上 研 究 显 示 ， 心 衰 正 在 成 为 我 国 心 血 管 病 领 域 的 重 要 公 共 卫 生 问 题 ， 且 随 着 冠 心 病 及 高 血 压 越 来 越 多 ， 心 衰 患 者 也 在 不 断 增 加 。 寻 求 一 种 简 单 可 行 的 方 法 ， 来 判 断 心 衰 预 后 ， 并 指 导 治 疗 是 心 衰 的 研 究 方 向 之 一 。 现 对 Ghrelin 的 研 究 现 状 简 述 如 下 1 Ghrelin 的 一 般 结 构 Ghrelin 在 99 年 被 证 实 为 生 长 激 素 促 分 泌 激 素 受 体 （ growth hormone secretagogue-receptor， GHSR） 的 天 然 配 体 5， 是 由 28 个 氨 基 酸 组 成 的 小 分 子 多 肽 ， 分 子 量 为 3300Da， 其 N 端 第 3 位 的 丝 氨 基 酸 上 有 一 个 N 辛 酰 基 ， 对 于 维 持 ghrelin 的 活 性 是 必 需 的 ， 其 C 末 端 的 脯 氨 酸 精 氨 酸 （ P R） 结 构 为 其 识 别 部 位 。 Ghrelin 前 体 N 端 的 前 23 个 氨 基 酸 残 基 具 有 分 泌 信 号 肽 特 征 ， 从 第 24 位 的 甘 氨 酸 到 第 52 位 的 28 个 氨 基 酸 为 Ghrelin 序 列 ， 人 的 Ghrelin 氨 基 酸 排 列 顺 序 是 G S S F L S P E H Q R V Q Q R K E S K K P P A K L Q P R， 第 3 位 丝 氨 酸 残 基 N 端 辛 酰 基 化 ， 对 其 生 物 活 性 具 有 重 要 作 用 ， 其 中 前 4 个 氨 基 酸 片 断 (G S S F)是 Ghrelin 的 最 小 活 性 中 心 6， 7。 2 Ghrelin 的 受 体 ( GHSR)及 分 布 目 前 认 为 GSHR 主 要 有 GSHR1a 及 1b 两 种 亚 型 8。 GHSR1a 含 366 个 氨 基 酸 ， 有 7 个 跨 膜 域 ， 高 结 合 力 低 密 度 ， 可 结 合 酰 化 的 ghrelin 及 合 成 的 肽 类 非 肽 类 GHSs;而 GHSR1b 仅 含 289 个 氨 基 酸 ， 5 个 跨 膜 域 呈 高 结 合 力 ， 可 结 合 酰 化 和 未 酰 化 的 ghrelin。 可 能 存 在 第 三 种 即 CD36 样 受 体 ， 低 结 合 力 、 高 密 度 ， 只 与 肽 类 GHSs 结 合 。 GHS 的 促 分 泌 效 应 主 要 是 通 过 与 1a 型 GHSR 结 合 而 发 挥 的 。 Ia 型 的 mRNA 主 要 分 布 于 下 丘 脑 弓 状 核 、 腹 内 侧 核 、 漏 斗 核 、 海 马 区 及 腺 垂 体 等 部 位 ， 这 些 均 构 成 其 调 节 中 枢 内 分 泌 作 用 的 结 构 基 础 ， GHSR 除 在 脑 内 的 中 枢 组 织 分 布 ， 还 在 肠 、 心 脏 、 胰 腺 、 脂 肪 组 织 及 肾 中 广 泛 表 达 且 存 在 不 同 亚 型 。 最 引 人 注 目 的 是 在 心 脏 和 血 管 包 括 冠 状 动 脉 血 管 中 有 GHRP 选 择 性 受 体 。 人 类 和 大 鼠 的 心 肌 细 胞 自 身 可 合 成 和 分 泌 Ghrelin， 在 其 心 脏 和 血 管 中 均 有 GHSR 存 在 9， 提 示 Ghrelin 在 心 肌 可 能 具 有 旁 分 泌 /自 分 泌 功 能 ， 从 而 发 挥 相 应 的 心 血 管 效 应 。 3 对 心 血 管 的 作 用 3 1 对 血 压 及 心 率 的 影 响 Makin 分 别 检 测 了 非 妊 娠 、 正 常 妊 娠 、 合 并 妊 娠 高 血 压 综 合 征 和 产 后 妇 女 的 血 浆 Ghrelin 水 平 。 结 果 显 示 正 常 妊 娠 妇 女 血 浆 Ghrelin 浓 度 和 血 压 呈 负 相 关 。 合 并 妊 娠 高 血 压 综 合 征 妇 女 Ghrelin 水 平 高 于 正 常 妊 娠 妇 女 。 与 血 压 呈 负 相 关 ， 提 示 在 正 常 和 异 常 妊 娠 中 Ghrelin 对 血 压 可 能 有 一 定 作 用 。 Ghrelin 是 一 种 不 依 赖 于 内 皮 功 能 的 血 管 扩 张 剂 ， 可 以 对 抗 内 皮 素 1 的 血 管 收 缩 作 用 。 正 常 志 愿 者 给 予 Ghrelin 后 ， 可 以 降 低 平 均 动 脉 压 及 系 统 性 血 管 紧 张 10。 为 证 明 ghrelin 在 人 体 是 否 有 直 接 的 舒 血 管 效 应 ， Okumura 等 11对 8 位 健 康 志 愿 者 动 脉 给 予 Ghrelin 后 对 其 前 臂 血 流 (FBF， forearm blood flow)进 行 测 定 ， 表 明 其 呈 剂 量 依 赖 性 增 加 FBF， 该 效 应 在 Makino Y12的 实 验 中 也 被 证 实 ， 同 时 证 明 其 舒 血 管 效 应 的 发 挥 可 不 依 赖 GH/IGF-1/NO 途 径 。 Shimizu 等 13通 过 皮 下 注 射 Ghrelin 可 改 善 GH 缺 陷 大 鼠 的 血 管 内 皮 功 能 失 调 并 增 加 eNOS 的 表 达 。 因 为 缺 乏 GH， 则 乙 酰 胆 碱 诱 导 的 血 管 舒 张 作 用 被 损 害 ， 同 样 也 证 明 其 舒 血 管 效 应 为 非 GH/IGF/NO 途 径 所 介 导 。 以 上 研 究 表 明 ： Ghrelin 具 有 直 接 的 扩 血 管 作 用 。 Ghrelin 可 刺 激 GH 分 泌 ， 提 高 GH/胰 岛 素 样 生 长 因 子 1(IGF 1)轴 的 活 性 ， 已 有 研 究 10证 实 IGF 1 通 过 刺 激 一 氧 化 氮 的 合 成 而 具 有 血 管 舒 张 的 作 用 ， 因 此 ， Ghrelin 具 有 直 接 和 间 接 的 扩 血 管 作 用 。 Nagaya N 等 对 12 名 心 衰 病 人 静 脉 给 予 ghrelin (0.1g/kg/min)后 ， 显 著 降 低 了 平 均 动 脉 压 (MAP)， 且 心 率 无 明 显 变 化 ， 并 显 著 增 加 了 心 指 数 (CI)和 每 搏 量 ， 且 平 均 肺 功 脉 压 及 肺 毛 细 血 管 楔 压 (PCWP)变 化 不 明 显 14。 动 物 实 验 也 显 示 Ghrelin 能 够 引 起 CHF 大 鼠 平 均 动 脉 压 的 明 显 降 低 15。 3 2 Ghrelin 对 心 衰 的 影 响 曾 报 道 在 原 发 性 扩 张 性 心 肌 病 中 联 合 GH 治 疗 证 明 是 有 效 的 ， 后 来 经 随 机 、 双 盲 、 空 白 -对 照 实 验 也 证 明 GH 具 有 治 疗 慢 性 心 衰 的 作 用 ， 据 此 ， ghrelin 也 有 治 疗 原 发 性 扩 张 性 心 肌 病 的 潜 在 作 用 。 Chang 的 研 究 显 示 外 源 性 补 充 ghrelin 能 明 显 减 轻 了 败 血 症 休 克 大 鼠 的 心 脏 功 能 障 碍 和 心 肌 损 伤 16。 研 究 报 道 ， 给 慢 性 心 衰 大 鼠 皮 下 注 射 Ghrelin 可 明 显 改 善 左 心 室 功 能 ， 表 现 为 心 输 出 量 增 加 ， 左 心 室 压 力 最 大 变 化 量 增 加 ， 抑 制 了 心 室 的 肌 源 性 扩 张 ， 延 缓 心 源 性 恶 液 质 的 发 展 17， 18， 并 且 接 受 Ghrelin 治 疗 的 CHF 大 鼠 可 保 持 适 当 的 体 重 增 加 和 肌 肉 /骨 骼 的 比 率 19。 健 康 志 愿 者 静 脉 注 射 Ghrelin 后 ， 观 察 到 平 均 动 脉 压 显 著 降 低 而 心 率 无 明 显 变 化 ， 而 且 心 脏 指 数 和 每 搏 输 出 量 指 数 增 加 ， 而 产 生 有 益 的 血 液 动 力 学 效 应 ， 减 轻 心 脏 后 负 担 ， 对 心 脏 有 保 护 作 用 。 结 合 这 些 资 料 ， 推 测 ghrelin 可 能 作 用 于 其 外 周 受 体 ， 通 过 非 依 赖 于 生 长 激 素 释 放 的 效 应 而 发 挥 直 接 心 血 管 保 护 作 用 。 Ghrelin 具 有 刺 激 GH 分 泌 ， 还 能 直 接 舒 张 血 管 且 逆 转 血 管 内 皮 素 (ET)所 致 的 血 管 收 缩 作 用 ， 鉴 于 此 提 出 ghrelin 可 能 是 治 疗 慢 性 心 力 衰 竭 的 又 一 新 方 法 。 Ghrelin 抗 心 衰 作 用 主 要 从 改 善 左 室 功 能 失 调 及 心 衰 恶 病 质 来 实 现 ， 其 作 用 机 制 包 括 GH/IGF-1 依 赖 及 非 依 赖 途 径 ， 各 机 制 并 非 互 相 独 立 20。 Ghrelin 除 了 直 接 舒 张 血 管 ， 该 效 应 也 可 能 通 过 GH/IGF-1 途 径 实 现 (因 为 GH 可 以 促 IGF 1 生 成 ， 后 者 又 可 促 进 NO 的 合 成 )， 其 增 加 心 输 出 量 可 能 与 增 强 心 肌 收 缩 力 、 降 低 心 脏 后 负 荷 有 关 ； 也 可 能 通 过 抑 制 心 肌 细 胞 凋 亡 改 善 病 变 的 心 肌 结 构 和 心 功 能 21， 22， 23， 24； 调 节 能 量 代 谢 来 改 善 心 衰 恶 病 质 25。 3 3 Ghrelin 与 冠 心 病 Katugampola 等 报 道 了 冠 状 动 脉 粥 样 硬 化 模 型 的 小 鼠 ghrelin 受 体 密 度 较 对 照 组 高 30%-40%， 认 为 ghrelin 对 血 管 性 疾 病 有 潜 在 的 治 疗 作 用 26。 分 别 向 小 鼠 心 脏 、 冠 状 细 小 动 脉 以 及 新 生 心 肌 细 胞 灌 注 ghreiln， 表 现 冠 脉 灌 注 压 上 升 和 冠 状 动 脉 收 缩 。 此 效 应 可 被 L 型 钙 离 子 通 道 阻 断 剂 和 蛋 白 激 酶 C (PKC)阻 断 ， 表 明 ghrelin 收 缩 冠 状 动 脉 的 作 用 依 赖 于 钙 离 子 和 PKC， 也 提 示 ghrelin 有 自 身 的 心 脏 保 护 系 统 27。 Ghrelin 具 有 改 善 内 皮 功 能 、 增 加 内 皮 NOS 的 作 用 ； 是 内 皮 素 的 内 源 拮 抗 ， 可 显 著 抑 制 内 皮 素 诱 导 的 血 管 内 皮 损 伤 及 血 管 收 缩 效 应 28。 内 皮 素 过 度 表 达 是 促 进 血 管 钙 化 的 重 要 因 素 之 一 ， 应 用 ghrelin 可 抑 制 维 生 素 D3 和 尼 古 丁 诱 导 大 鼠 血 管 钙 化 ， 同 时 呈 浓 度 依 赖 性 降 低 血 管 平 滑 肌 细 胞 钙 化 ， 表 现 明 显 下 调 血 浆 内 皮 素 浓 度 及 血 管 组 织 的 内 皮 素 表 达 。 目 前 ， 动 脉 粥 样 硬 化 被 认 为 是 一 种 慢 性 炎 症 反 应 ， 与 白 细 胞 介 素 - 6( IL-6) ， C 反 应 蛋 白 (CRP) ， 肿 瘤 坏 死 因 子 - (TNF- ) 等 炎 症 因 子 密 切 相 关 。 Li WG 等 在 体 外 培 养 的 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 中 加 入 ghrelin 1h 后 再 加 入 TNF- 后 24h ， 发 现 ghrelin 能 抑 制 TNF- 介 导 的 IL-8 和 单 核 细 胞 趋 化 蛋 白 1 (MCP 1) 分 泌 29， 并 呈 剂 量 依 赖 性 。 另 有 研 究 发 T 淋 巴 细 胞 和 单 核 细 胞 均 可 表 达 ghrelin 和 GHSR， 并 且 ghrelin 通 过 与 其 受 体 的 结 合 抑 制 了 炎 性 细 胞 因 子 IL- 6、 TNF- 等 的 表 达 30。 心 肌 梗 死 后 大 鼠 给 予 Ghrelin， 可 抑 制 心 脏 交 感 神 经 活 性 和 阻 止 早 期 左 室 重 构 31。 并 有 报 道 指 出 单 倍 型 的 Ghrelin 的 配 体 和 受 体 基 因 的 上 位 互 动 作 用 影 响 心 肌 梗 塞 和 冠 状 动 脉 疾 病 易 感 性 32。 4 分 泌 调 节 Ghrelin 进 入 血 液 后 在 全 身 血 液 中 循 环 ， 正 常 人 血 浆 中 Ghrelin 的 浓 度 为 100 120 pmol/L， 空 腹 时 Ghrelin 水 平 与 insulin 负 相 关 33， 34， 与 BMI 呈 负 相 关 35 。 机 体 的 能 量 状 态 对 Ghrelin 的 表 达 也 有 一 定 影 响 ， 人 在 正 餐 前 、 禁 食 状 态 及 神 经 性 厌 食 症 病 人 的 血 浆 Ghrelin 浓 度 都 高 于 正 常 水 平 ， 而 正 餐 后 、 给 予 葡 萄 糖 及 单 纯 性 肥 胖 病 人 的 血 浆 Ghrelin 浓 度 均 低 于 正 常 水 平 36 ， 37 。 生 长 抑 素 可 抑 制 Ghrelin 释 放 38 ， 静 脉 注 入 210 gkg-1h -1 的 生 长 抑 制 素 120 min 后 可 抑 制 循 环 Ghrelin 水 平 至 基 础 值 55 % ， 停 止 注 入 生 长 抑 素 30 min 后 仍 可 见 明 显 抑 制 Ghrelin 作 用 ， 原 因 是 分 泌 Ghrelin 的 胃 肠 泌 酸 细 胞 内 也 广 泛 存 在 生 长 抑 素 受 体 从 而 抑 制 了 该 部 位 Ghrelin 的 释 放 。 Ghrelin 作 为 天 然 多 肽 ， 其 含 量 及 效 应 尺 度 的 调 节 包 括 一 系 列 复 杂 机 制 ， 如 ghrelin 基 因 的 转 录 与 翻 译 ;垂 体 酰 基 转 移 酶 对 ghrelin 分 子 进 行 分 析 的 辛 酰 化 修 饰 ;活 性 ghrelin 分 子 的 分 泌 及 转 运 等 。 Ghrelin 对 心 血 管 系 统 有 明 确 的 保 护 作 用 , 并 且 与 心 衰 有 着 密 切 关 系 。 但 ghrelin 在 心 衰 患 者 中 的 水 平 与 心 衰 的 程 度 的 关 系 以 及 对 心 衰 患 者 的 预 后 未 见 报 道 。 本 课 题 通 过 检 测 不 同 心 衰 程 度 患 者 血 清 中 ghrelin 的 水 平 ， 与 对 照 组 比 较 是 否 存 在 差 异 ， 其 水 平 的 高 低 是 否 与 心 衰 程 度 存 在 联 系 ， 以 及 随 访 心 衰 患 者 2 年 ， 观 察 其 与 心 衰 患 者 的 预 后 及 其 他 心 血 管 事 件 的 关 系 。 国 内 首 次 作 心 衰 患 者 ghrelin 水 平 的 研 究 ， 探 讨 其 在 慢 性 心 衰 过 程 中 可 能 扮 演 的 角 色 。 、 研究方法、技术路线、计划进度和阶段目标 实验方案的设计： 实 验 对 象 ： 本 院 心 内 科 符 合 美 国 心 脏 学 会 和 心 脏 病 协 会 2005 年 慢 性 心 衰 诊 断 标 准 的 心 衰 病 人 及 门 诊 健 康 体 检 者 。 并 作 慢 性 心 衰 调 查 表 统 计 病 例 资 料 （ 材 料 见 附 页 ） 。 50 70 岁 ， 男 女 各 半 。 实 验 分 组 1)健 康 对 照 组 （ 20 例 ） 2)心 衰 组 （ 80 例 ） a. 心 衰 A 期 组 （ 20 例 ） b. 心 衰 B 期 组 （ 20 例 ） c. 心 衰 C 期 组 （ 20 例 ） d. 心 衰 D 期 组 （ 20 例 ） 空 腹 8 12 小 时 ， 第 二 日 清 晨 空 腹 经 肘 静 脉 采 静 脉 血 4ml， 分 离 血 清 ， 根 据 试 剂 盒 说 明 ， 采 用 酶 联 免 疫 法 检 测 血 浆 中 的 ghrelin 的 水 平 。 统 计 学 分 析 ： 计 量 资 料 以 均 数 加 减 标 准 差 (xs)表 示 ,采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析 ,组 间 比 较 采 用 两 组 独 立 样 本 资 料 的 t 检 验 ,组 内 比 较 采 用 析 因 设 计 资 料 的 方 差 分 析 以 及 多 个 样 本 均 数 的 两 两 比 较 的 方 差 分 析 。 并 作 ghrelin 与 内 皮 素 的 关 联 性 分 析 。 检 验 水 准 =0.05， P0.05 为 差 异 有 统 计 学 意 义 。 参 考 文 献 ： 1Hunt SA,Baker DM,Chin MN,etal. 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